Perbezaan Antara Mikroskop Pendarfluor dan Mikroskop Biasa
1. Lihat kaedah pencahayaan
Kaedah pencahayaan mikroskop pendarfluor secara amnya adalah jenis epi, iaitu, sumber cahaya diletakkan pada sampel ujian melalui kanta objektif.
2. Tengok resolusi
Mikroskop pendarfluor menggunakan cahaya ultraviolet sebagai sumber cahaya, dengan panjang gelombang yang agak pendek, tetapi resolusinya lebih tinggi daripada mikroskop optik biasa.
3, perbezaan dalam penapis
Mikroskop pendarfluor menggunakan dua penapis khas, digunakan di hadapan sumber cahaya untuk menapis cahaya yang boleh dilihat, dan digunakan di antara kanta objektif dan kanta mata untuk menapis cahaya ultraviolet, yang boleh melindungi mata manusia.
Mikroskop pendarfluor juga merupakan sejenis mikroskop optik, terutamanya kerana panjang gelombang yang teruja oleh mikroskop pendarfluor adalah pendek, jadi ini membawa kepada perbezaan dalam struktur dan penggunaan mikroskop pendarfluor dan mikroskop biasa. Kebanyakan mikroskop pendarfluor mempunyai fungsi yang baik untuk menangkap cahaya yang lemah. , jadi di bawah pendarfluor yang sangat lemah, keupayaan pengimejannya juga baik. Ditambah dengan peningkatan berterusan mikroskop pendarfluor dalam beberapa tahun kebelakangan ini, bunyi bising juga telah dikurangkan dengan banyak. Oleh itu, semakin banyak mikroskop pendarfluor digunakan.
Pengetahuan tentang Mikroskopi Pendarfluor Dua Foton
Prinsip asas pengujaan dua foton ialah: dalam kes ketumpatan foton tinggi, molekul pendarfluor boleh menyerap dua foton panjang gelombang pada masa yang sama, dan selepas jangka hayat keadaan teruja yang sangat singkat, memancarkan foton panjang gelombang pendek. ; kesannya adalah sama seperti menggunakan foton dengan panjang gelombang separuh panjang gelombang panjang untuk merangsang molekul pendarfluor. Pengujaan dua foton memerlukan ketumpatan foton yang tinggi, dan untuk tidak merosakkan sel, mikroskop dua foton menggunakan laser berdenyut terkunci mod tenaga tinggi. Laser ini memancarkan cahaya laser dengan tenaga puncak tinggi dan tenaga purata rendah, dengan lebar nadi hanya 100 femtosaat dan frekuensi 80 hingga 100 MHz. Apabila kanta objektif apertur berangka tinggi digunakan untuk memfokuskan foton laser berdenyut, ketumpatan foton pada titik fokus kanta objektif adalah yang tertinggi, dan pengujaan dua foton berlaku hanya pada titik fokus kanta objektif, jadi mikroskop dua foton tidak memerlukan lubang jarum confocal, yang meningkatkan kecekapan pengesanan Pendarfluor.
Dalam fenomena pendarfluor umum, disebabkan oleh ketumpatan foton rendah cahaya pengujaan, molekul pendarfluor hanya boleh menyerap satu foton pada masa yang sama, dan kemudian memancarkan foton pendarfluor melalui peralihan sinaran, yang dipanggil pendarfluor foton tunggal. Untuk proses pengujaan pendarfluor dengan laser sebagai sumber cahaya, fenomena pendarfluor dua foton atau berbilang foton mungkin berlaku. Pada masa ini, keamatan sumber cahaya pengujaan yang digunakan adalah tinggi, dan ketumpatan foton memenuhi keperluan bahawa molekul pendarfluor menyerap dua foton pada masa yang sama. Dalam proses menggunakan laser am sebagai sumber cahaya pengujaan, ketumpatan foton masih tidak mencukupi untuk menghasilkan penyerapan dua foton. Biasanya, laser berdenyut femtosaat digunakan, dan kuasa serta-mertanya boleh mencapai susunan megawatt. Oleh itu, panjang gelombang pendarfluor dua foton adalah lebih pendek daripada panjang gelombang cahaya pengujaan, yang bersamaan dengan kesan yang dihasilkan oleh pengujaan panjang gelombang separuh pengujaan.
Mikroskopi pendarfluor dua foton mempunyai banyak kelebihan:
1) Cahaya gelombang panjang kurang terjejas oleh penyerakan berbanding cahaya panjang gelombang pendek dan boleh menembusi spesimen dengan mudah;
2) Molekul pendarfluor di luar satah fokus tidak teruja, supaya lebih banyak cahaya pengujaan boleh mencapai satah fokus, supaya cahaya pengujaan dapat menembusi spesimen yang lebih dalam;
3) Cahaya dekat-inframerah panjang gelombang panjang kurang toksik kepada sel daripada cahaya panjang gelombang pendek;
4) Apabila melihat spesimen dengan mikroskop dua foton, pelunturan foto dan fototoksikan hanya terdapat pada satah fokus. Oleh itu, mikroskop dua foton lebih sesuai untuk melihat spesimen tebal daripada mikroskop foton tunggal, untuk melihat sel hidup, atau untuk melakukan eksperimen pemutihan foto titik tetap.
Pengetahuan tentang mikroskop pendarfluor confocal
Prinsip asas mikroskop pendarfluor confocal: menggunakan sumber cahaya titik untuk menerangi spesimen, titik cahaya kecil dengan garis besar yang jelas terbentuk pada satah fokus. terdiri daripada pembahagi rasuk. Pembahagi rasuk menghantar pendarfluor terus ke pengesan. Terdapat lubang jarum di hadapan sumber cahaya dan pengesan, masing-masing dipanggil lubang jarum pencahayaan dan lubang jarum pengesan. Dimensi geometri kedua-duanya adalah sama, kira-kira 100-200 nm; berbanding dengan titik cahaya pada satah fokus, kedua-duanya adalah konjugat, iaitu, titik cahaya melalui satu siri kanta, dan akhirnya boleh difokuskan pada lubang jarum pencahayaan dan lubang jarum pengesanan pada masa yang sama. Dengan cara ini, cahaya dari satah fokus boleh tertumpu dalam julat lubang pengesanan, manakala cahaya yang berselerak dari atas atau bawah satah fokus disekat keluar dari lubang pengesanan dan tidak boleh diimej. Sampel diimbas titik demi titik dengan laser, dan tiub photomultiplier selepas mengesan lubang jarum juga memperoleh imej confocal titik cahaya titik demi titik yang sepadan, yang ditukar menjadi isyarat digital dan dihantar ke komputer, dan akhirnya diagregatkan pada skrin menjadi imej konfokal yang jelas bagi keseluruhan satah fokus. .
Setiap imej satah fokus sebenarnya adalah keratan rentas optik spesimen, dan keratan rentas optik ini sentiasa mempunyai ketebalan tertentu, juga dikenali sebagai hirisan optik. Oleh kerana keamatan cahaya pada titik fokus adalah jauh lebih besar daripada di titik bukan fokus, dan cahaya satah bukan fokus ditapis keluar oleh lubang jarum, kedalaman medan sistem confocal adalah lebih kurang sifar, dan mengimbas sepanjang Paksi Z boleh merealisasikan tomografi optik, membentuk Perhatikan bahagian optik dua dimensi di tempat fokus sampel. Menggabungkan imbasan satah XY (satah fokus) dengan imbasan paksi Z (paksi optik), dengan mengumpul imej dua dimensi lapisan berturut-turut dan pemprosesan oleh perisian komputer khas, imej tiga dimensi sampel boleh diperolehi.
Iaitu, lubang jarum pengesanan dan lubang jarum sumber cahaya sentiasa difokuskan pada titik yang sama, supaya pendarfluor yang teruja di luar satah fokus tidak boleh memasuki lubang jarum pengesanan.
Ungkapan ringkas prinsip kerja laser confocal ialah ia menggunakan laser sebagai sumber cahaya, dan berdasarkan pengimejan mikroskop pendarfluor tradisional, peranti pengimbasan laser dan peranti pemfokus konjugat dilampirkan, dan pemerolehan dan pemprosesan imej digital. sistem dikawal oleh komputer.
