Mikroskopi pendarfluor berbeza daripada mikroskopi konvensional
Mikroskop pendarfluor menggunakan cahaya ultraviolet sebagai sumber cahaya untuk menyinari objek yang akan diperiksa, supaya objek memancarkan cahaya, dan kemudian memerhati objek di bawah mikroskop. Ia digunakan terutamanya untuk sel imunofluoresensi. Ia terutamanya terdiri daripada sumber cahaya, sistem plat penapis dan sistem optik untuk memerhati imej pendarfluor sampel melalui pembesaran kanta mata dan kanta objektif. Mari kita lihat perbezaan antara mikroskop pendarfluor ini dan mikroskop optik biasa.
1. Lihat kaedah pencahayaan
Kaedah pencahayaan mikroskop pendarfluor secara amnya adalah episkopik, iaitu, sumber cahaya ditayangkan pada sampel ujian melalui kanta objektif.
2. Tengok resolusi
Mikroskop pendarfluor menggunakan cahaya ultraviolet sebagai sumber cahaya, dan panjang gelombangnya agak pendek, tetapi resolusinya lebih tinggi daripada mikroskop optik biasa.
3. Perbezaan penapis
Mikroskop pendarfluor menggunakan dua penapis khas, yang digunakan di hadapan sumber cahaya untuk menapis cahaya yang boleh dilihat, dan digunakan di antara kanta objektif dan kanta mata untuk menapis sinar ultraviolet, yang boleh melindungi mata manusia.
Mikroskop pendarfluor juga merupakan sejenis mikroskop optik, terutamanya kerana panjang gelombang yang teruja oleh mikroskop pendarfluor adalah pendek, jadi ini membawa kepada perbezaan dalam struktur dan penggunaan antara mikroskop pendarfluor dan mikroskop biasa. Kebanyakan mikroskop pendarfluor mempunyai fungsi yang baik untuk menangkap cahaya yang lemah, jadi di bawah pendarfluor yang sangat lemah, keupayaan pengimejannya juga baik. Ditambah dengan peningkatan berterusan mikroskop pendarfluor dalam beberapa tahun kebelakangan ini, bunyi bising juga telah dikurangkan dengan banyak. Oleh itu semakin banyak mikroskop pendarfluor digunakan.
sepasang
Pengetahuan tentang Photon Fluorescence Microscopy
Prinsip asas pengujaan dua foton ialah: dalam kes ketumpatan foton yang tinggi, molekul pendarfluor boleh menyerap dua foton panjang gelombang pada masa yang sama, dan memancarkan foton panjang gelombang yang lebih pendek selepas jangka hayat keadaan teruja yang singkat; kesannya adalah sama seperti menggunakan foton dengan separuh panjang gelombang daripada panjang gelombang panjang untuk merangsang molekul pendarfluor. Pengujaan dua foton memerlukan ketumpatan foton yang tinggi. Untuk tidak merosakkan sel, mikroskop dua foton menggunakan laser berdenyut terkunci mod tenaga tinggi. Laser yang dipancarkan oleh laser ini mempunyai tenaga puncak yang tinggi dan tenaga purata yang rendah, lebar nadinya hanya 100 femtosaat, dan frekuensinya boleh mencapai 80 hingga 100 megahertz. Apabila menggunakan kanta objektif apertur berangka tinggi untuk memfokuskan foton laser berdenyut, ketumpatan foton pada titik fokus kanta objektif adalah yang tertinggi, dan pengujaan dua foton hanya berlaku pada titik fokus kanta objektif, jadi mikroskop dua foton tidak memerlukan lubang jarum confocal, yang meningkatkan kecekapan pengesanan pendarfluor.
Dalam fenomena pendarfluor am, disebabkan oleh ketumpatan foton cahaya pengujaan yang rendah, molekul pendarfluor hanya boleh menyerap satu foton pada masa yang sama, dan kemudian memancarkan foton pendarfluor melalui peralihan sinaran, iaitu pendarfluor foton tunggal. Untuk proses pengujaan pendarfluor menggunakan laser sebagai sumber cahaya, pendarfluor dua foton atau berbilang foton mungkin berlaku. Pada masa ini, keamatan sumber cahaya pengujaan yang digunakan adalah tinggi, dan ketumpatan foton memenuhi keperluan molekul pendarfluor yang menyerap dua foton pada masa yang sama. Dalam proses menggunakan laser am sebagai sumber cahaya pengujaan, ketumpatan foton masih tidak mencukupi untuk menghasilkan fenomena penyerapan dua foton. Biasanya, laser berdenyut femtosaat digunakan, dan kuasa serta-mertanya boleh mencapai susunan megawatt. Oleh itu, panjang gelombang pendarfluor dua foton adalah lebih pendek daripada panjang gelombang cahaya pengujaan, yang bersamaan dengan kesan yang dihasilkan oleh pengujaan pada separuh panjang gelombang pengujaan.
Mikroskopi pendarfluor dua foton mempunyai banyak kelebihan:
1) Cahaya gelombang panjang kurang terjejas oleh penyerakan berbanding cahaya gelombang pendek dan mudah menembusi spesimen;
2) Molekul pendarfluor di luar satah fokus tidak teruja, supaya lebih banyak cahaya pengujaan boleh mencapai satah fokus, supaya cahaya pengujaan dapat menembusi spesimen yang lebih dalam;
3) Cahaya dekat-inframerah panjang gelombang panjang kurang toksik kepada sel daripada cahaya panjang gelombang pendek;
4) Apabila menggunakan mikroskop dua foton untuk memerhati spesimen, pelunturan foto dan fototoksisiti berlaku hanya pada satah fokus. Oleh itu, mikroskop dua foton adalah lebih sesuai daripada mikroskop foton tunggal untuk memerhati spesimen tebal, untuk memerhati sel hidup, atau untuk eksperimen pemutihan foto tempat.
Pengetahuan tentang mikroskop pendarfluor confocal
Prinsip asas mikroskop pendarfluor confocal: sampel disinari oleh sumber cahaya titik, dan titik cahaya yang kecil dan jelas terbentuk pada satah fokus. Selepas titik disinari, pendarfluor yang dipancarkan dikumpulkan oleh kanta objektif dan dihantar semula ke pembahagi rasuk yang terdiri daripada cermin dikroik di sepanjang laluan pencahayaan asal. Pembahagi rasuk menghantar pendarfluor terus ke pengesan. Terdapat lubang jarum di hadapan sumber cahaya dan pengesan, masing-masing dipanggil lubang jarum pencahayaan dan lubang jarum pengesan. Saiz geometri kedua-duanya adalah sama, kira-kira 100-200nm; berbanding dengan titik cahaya pada satah fokus, kedua-duanya adalah konjugat, iaitu, titik cahaya melalui satu siri kanta, dan akhirnya boleh difokuskan pada lubang jarum pencahayaan dan lubang jarum pengesanan pada masa yang sama. Dengan cara ini, cahaya dari satah fokus boleh menumpu dalam skop lubang pengesanan, manakala cahaya yang berselerak dari atas atau bawah satah fokus disekat di luar lubang pengesanan dan tidak boleh diimej. Laser mengimbas titik sampel demi titik, dan tiub photomultiplier selepas mengesan lubang jarum juga memperoleh imej confocal bagi titik titik cahaya yang sepadan dengan titik, yang ditukar menjadi isyarat digital dan dihantar ke komputer, dan akhirnya diagregatkan menjadi jelas. imej confocal bagi keseluruhan satah fokus pada skrin.
Setiap imej satah fokus sebenarnya adalah keratan rentas optik spesimen, dan keratan rentas optik ini sentiasa mempunyai ketebalan tertentu, juga dikenali sebagai keratan nipis optik. Memandangkan keamatan cahaya pada titik fokus adalah jauh lebih besar daripada pada titik bukan fokus, dan cahaya satah bukan fokus ditapis keluar oleh lubang jarum, kedalaman medan sistem confocal adalah lebih kurang sifar, dan mengimbas sepanjang Paksi Z boleh merealisasikan tomografi optik, membentuk kepingan optik dua dimensi di tempat fokus sampel untuk diperhatikan. Menggabungkan pengimbasan satah XY (satah fokus) dengan pengimbasan paksi Z (paksi optik), imej tiga dimensi sampel boleh diperoleh dengan mengumpul imej dua dimensi lapisan berterusan dan diproses oleh perisian komputer khas.
Iaitu, lubang jarum pengesanan dan lubang jarum sumber cahaya sentiasa tertumpu pada titik yang sama, supaya pendarfluor yang teruja di luar satah fokus tidak boleh memasuki lubang jarum pengesanan.
Ungkapan ringkas prinsip kerja laser confocal ialah ia menggunakan cahaya laser sebagai sumber cahaya. Berdasarkan pengimejan mikroskop pendarfluor tradisional, ia menambah peranti pengimbasan laser dan peranti pemfokus konjugat, dan ia adalah sistem untuk pemerolehan dan pemprosesan imej digital melalui kawalan komputer.
