Bagaimanakah morfologi sel mikrob diperhatikan di bawah mikroskop?
Mikroskop dicipta untuk melihat objek tersenyum yang tidak dapat dilihat dengan mata kasar. Mikroorganisma adalah sangat kecil, jadi ia mesti dibesarkan dan diperhatikan dengan bantuan mikroskop. Di samping itu, terdapat banyak jenis mikroorganisma, jadi pada asasnya kebanyakan mikroskop optik boleh memerhati mikroorganisma. Soalan seterusnya ialah jenis mikroskop yang patut digunakan untuk pemerhatian dan analisis jenis mikroorganisma. Mikroskop biasa yang boleh digunakan untuk memerhati morfologi mikrob termasuk mikroskop biologi, mikroskop kontras fasa, mikroskop terbalik, mikroskop pendarfluor, mikroskop confocal, dsb.
Berikut menerangkan pelbagai mikroskop yang digunakan untuk memerhati mikroorganisma:
1. Mikroskop optik biasa menggunakan cahaya semula jadi atau cahaya sebagai sumber cahaya, dan panjang gelombangnya adalah kira-kira 0.4 μm. Resolusi mikroskop ialah separuh daripada panjang gelombang, iaitu, 0.2 μm, dan imej terkecil yang boleh dilihat dengan mata kasar ialah 0.2 mm. Oleh itu, menggunakan cermin minyak (rendam) untuk membesarkan 1000 kali boleh membesarkan zarah 0.2μm kepada 0.2mm yang boleh dilihat dengan mata kasar. Mikroskop optik biasa boleh digunakan untuk pemerhatian bakteria, actinomycetes dan kulat.
2. Mikroskopi medan gelap biasanya digunakan untuk memerhati morfologi dan pergerakan mikrob yang tidak tercemar. Selepas pemeluwap medan gelap dipasang dalam mikroskop biasa, cahaya tidak dapat menembusi terus dari tengah, dan medan pandangan gelap. Apabila spesimen menerima cahaya serong dari tepi pemeluwap, ia boleh bertaburan, jadi mikroorganisma terang seperti bakteria atau spirochetes boleh diperhatikan dalam latar belakang medan gelap.
3. Mikroskop kontras fasa Mikroskop kontras fasa menggunakan kesan cahaya plat perbezaan fasa untuk menukar fasa cahaya dan amplitud cahaya langsung, dan menukar perbezaan fasa cahaya kepada perbezaan keamatan cahaya. Di bawah mikroskop fasa-kontras, apabila cahaya melalui spesimen yang tidak bernoda, perbezaan dalam fasa cahaya disebabkan oleh ketidakkonsistenan ketumpatan bahagian spesimen yang berlainan, dan morfologi, struktur dalaman dan mod pergerakan mikroorganisma boleh diperhatikan.
4. Mikroskop pendarfluor Mikroskop pendarfluor pada dasarnya adalah sama seperti mikroskop optik biasa, perbezaan utama ialah sumber cahaya, penapis dan pemeluwap. Pada masa ini, kebanyakan mereka menggunakan peranti epi-cahaya, dan lampu merkuri tekanan tinggi biasanya digunakan sebagai sumber cahaya, yang boleh mengeluarkan cahaya ultraungu atau biru-ungu. Terdapat dua jenis penapis: penapis pengujaan dan penapis penyerapan. Sebagai tambahan kepada pemeluwap medan terang am, pemeluwap medan gelap juga boleh digunakan dalam mikroskop pendarfluor menggunakan cahaya biru untuk meningkatkan kontras antara pendarfluor dan latar belakang. Kaedah ini boleh digunakan untuk pengesanan atau pengecaman bakteria yang diwarnai dengan pigmen pendarfluor atau digabungkan dengan antibodi pendarfluor.
5. Mikroskop elektron menggunakan aliran elektron sebagai sumber cahaya, dan panjang gelombang adalah berpuluh-puluh ribu kali berbeza daripada cahaya yang boleh dilihat, yang sangat meningkatkan resolusi. Ia juga menggunakan gegelung magnet sebagai sistem penguatan optik, dan pembesaran boleh mencapai puluhan ribu atau ratusan ribu kali. Ia sering digunakan untuk pemerhatian zarah virus dan ultrastruktur bakteria.
Pemerhatian spesimen mikrob yang tidak tercemar:
Spesimen yang tidak diwarnakan secara amnya boleh digunakan untuk memerhati morfologi, kuasa dan pergerakan bakteria. Bakteria tidak berwarna dan lutsinar apabila tidak dicemari, dan diperhatikan di bawah mikroskop terutamanya oleh perbezaan antara indeks biasan bakteria dan persekitaran sekeliling. Bakteria dengan flagela bergerak dengan cergas, manakala bakteria tanpa flagela menunjukkan gerakan Brown yang tidak teratur. Bakteria yang berdaya maju seperti Treponema pallidum, Leptospira, dan Campylobacter mempunyai bentuk dan corak pergerakan yang tersendiri, yang mempunyai kepentingan diagnostik. Kaedah yang biasa digunakan ialah kaedah penurunan tekanan, kaedah penurunan loket dan kaedah kapilari.
1. Sapukan Vaseline di sekeliling lubang cekung kaca cekung bersih dengan kaedah gantung, gunakan gelung inokulasi untuk mengambil cincin ampaian bakteria dan letakkan di tengah kaca penutup, kemudian selaraskan lubang cekung kaca cekung dengan titisan di tengah kaca penutup dan tutupnya, kemudian terbalikkannya dengan cepat, tekan kaca penutup perlahan-lahan untuk menjadikannya melekat rapat pada Vaseline di tepi lubang cekung, dan amati di bawah mikroskop pembesaran tinggi (atau medan gelap).
2. Ambil cincin ampaian bakteria dengan gelung inokulasi dan letakkannya di tengah gelongsor kaca bersih dengan kaedah penurunan tekanan, dan tutup ampaian bakteria dengan kaca penutup perlahan-lahan, berhati-hati untuk mengelakkan buih dan limpahan ampaian bakteria . Selepas berdiri diam selama beberapa saat, amati di bawah mikroskop berkuasa tinggi dalam medan terang (atau medan gelap).
3. Kaedah kapilari digunakan terutamanya untuk pemeriksaan kinetik bakteria anaerobik. Biasanya pilih 60~70mm panjang. Selepas menyedut penggantungan bakteria anaerobik melalui kapilari dengan apertur 0.5-1.0 mm, tutup kedua-dua hujung kapilari dengan nyalaan. Kapilari dipasang pada slaid kaca dengan kertas plastik, dan diperhatikan di bawah kanta berkuasa tinggi dalam medan gelap.
Pemerhatian spesimen mikrob bernoda dengan mikroskop:
Selepas spesimen bakteria diwarnakan, disebabkan oleh kontras yang ketara dalam warna antara bakteria dan persekitaran sekeliling, ciri-ciri morfologi bakteria (seperti saiz, bentuk, susunan, dll.) bakteria dan beberapa struktur khas (seperti sebagai kapsul, flagela, spora, dll.) boleh diperhatikan dengan jelas di bawah mikroskop optik biasa, dan bakteria boleh dikelaskan dan dikenal pasti mengikut kereaktifan pewarnaan.
(1) Prosedur am pewarnaan bakteria Prosedur am pewarnaan bakteria ialah: sapuan (pengeringan)—penetapan—pewarnaan.
1. Smear Penyediaan darah, rembesan, perkumuhan, cecair tusukan dan kultur cecair, dan sapuan filem nipis terus pada slaid kaca; bedah siasat atau tisu haiwan yang dijangkiti, sapukan lesi dengan swab kapas untuk pensampelan. Untuk penyediaan koloni bakteria atau rumput pada medium pepejal, mula-mula gunakan gelung inokulasi untuk mengambil cincin garam biasa dan letakkan di tengah-tengah slaid kaca, kemudian gunakan gelung inokulasi steril untuk mengambil sedikit kultur dan mengisar. ia sama rata dalam garam biasa, ratakan ke dalam permukaan bersalut 1cm2, dan biarkan ia kering secara semula jadi pada suhu bilik atau perlahan-lahan kering pada jarak yang jauh.
2. Tujuan penetapan adalah untuk membunuh bakteria, menggumpal protein dan struktur bakteria, dan memudahkan pewarnaan; menggalakkan bakteria untuk melekat pada slaid untuk mengelakkan dihanyutkan oleh air semasa mencuci; menukar kebolehtelapan bakteria kepada pewarna, yang bermanfaat untuk pewarnaan struktur intrasel bakteria. Ia biasanya diperbaiki dengan memanaskan dengan nyalaan, dan sapuan kering dengan cepat disalurkan melalui nyalaan selama 3 kali. Adalah lebih baik untuk tidak membakar kulit di belakang tangan apabila ia menyentuh gelongsor.
3. Mencelup Mengikut tujuan pemeriksaan yang berbeza, pilih kaedah pencelupan yang berbeza untuk pencelupan. Semasa mencelup, tambah larutan pewarna secara titisan untuk meningkatkan litupan.
4. Mordant Mana-mana bahan yang boleh meningkatkan pertalian antara pewarna dan objek yang dicelup, menetapkan pewarna pada objek yang dicelup dan menyebabkan perubahan dalam kebolehtelapan membran sel dipanggil mordan. Yang biasa digunakan ialah tawas, asid tannic, garam logam dan iodin, dsb., dan pemanasan juga digunakan untuk menggalakkan pewarnaan. Mordants boleh digunakan antara pewarnaan primer dan pewarnaan balas, dan juga boleh digunakan selepas penetapan atau terkandung dalam fiksatif dan pewarnaan.
5. Penyahwarnaan Sebarang agen kimia yang boleh menghilangkan warna objek yang dicelup dipanggil penyahwarna. Etanol, aseton, dsb. biasanya digunakan sebagai penyahwarna. Ejen penyahwarna boleh mengesan tahap kestabilan gabungan bakteria dan pewarna, yang boleh digunakan untuk pewarnaan pembezaan.
6. Counterstaining Bakteria atau strukturnya yang telah dinyahwarna selalunya diwarnakan dengan larutan counterstain untuk memudahkan pemerhatian. Warna larutan pewarna balas adalah berbeza daripada larutan pencelupan primer untuk membentuk kontras yang tajam. Pewarnaan balas tidak boleh terlalu kuat, supaya tidak menutup warna pewarnaan awal.
