Pengetahuan berkaitan mikroskopi pendarfluor confocal
Prinsip asas mikroskopi pendarfluor confocal adalah menggunakan sumber cahaya titik untuk menyinari spesimen, membentuk titik kecil yang jelas pada satah fokus. Pendarfluor yang dipancarkan oleh tempat selepas penyinaran dikumpulkan oleh kanta objektif dan dihantar semula ke spektrofotometer yang terdiri daripada cermin warna dua arah di sepanjang laluan penyinaran asal. Spektrofotometer menghantar pendarfluor terus kepada pengesan. Terdapat dua lubang jarum di hadapan sumber cahaya dan pengesan, masing-masing dipanggil lubang jarum pencahayaan dan lubang jarum pengesan. Dimensi geometri kedua-duanya adalah konsisten, kira-kira 100-200nm; Berbanding dengan titik cahaya pada satah fokus, kedua-duanya adalah konjugat, bermakna titik cahaya melalui satu siri kanta dan akhirnya boleh memfokus pada kedua-dua lubang jarum pencahayaan dan lubang jarum pengesanan secara serentak. Dengan cara ini, cahaya dari satah fokus boleh menumpu dalam julat lubang pengesanan, manakala cahaya bertaburan dari atas atau bawah satah fokus disekat di luar lubang pengesanan dan tidak boleh diimej. Dengan mengimbas titik sampel demi titik dengan laser, tiub photomultiplier selepas mengesan lubang jarum juga memperoleh imej confocal yang sepadan bagi titik titik cahaya demi titik, yang ditukar menjadi isyarat digital dan dihantar ke komputer. Akhir sekali, imej konfokal yang jelas bagi keseluruhan satah fokus disintesis pada skrin.
Setiap imej satah fokus sebenarnya adalah keratan rentas optik spesimen, yang sentiasa mempunyai ketebalan tertentu, juga dikenali sebagai bahagian nipis optik. Disebabkan fakta bahawa keamatan cahaya pada titik fokus adalah jauh lebih besar daripada pada titik bukan fokus, dan cahaya satah bukan fokus ditapis keluar oleh lubang jarum, kedalaman medan sistem confocal adalah lebih kurang sifar. Mengimbas sepanjang arah paksi Z boleh mencapai tomografi optik, membentuk kepingan optik dua dimensi di tempat fokus sampel yang diperhatikan. Dengan menggabungkan pengimbasan satah XY (satah fokus) dengan paksi Z (paksi optik), imej tiga dimensi sampel boleh diperoleh dengan mengumpul lapisan berterusan imej dua dimensi dan memprosesnya dengan perisian komputer khusus.
Lubang jarum pengesanan dan lubang jarum sumber cahaya sentiasa difokuskan pada titik yang sama, supaya pendarfluor yang teruja di luar satah fokus tidak boleh memasuki lubang jarum pengesanan.
Ungkapan ringkas prinsip kerja mikroskop confocal laser ialah ia menggunakan laser sebagai sumber cahaya, dan menambah peranti pengimbasan laser dan peranti memfokus konjugat berdasarkan pengimejan mikroskop pendarfluor tradisional. Ia adalah sistem yang dikawal oleh komputer untuk pemerolehan dan pemprosesan imej digital.
