Bilik Darjah Pengimejan Mikroskopik丨Aplikasi Mikroskopi Pendarfluor
Mikroskopi pendarfluor pantulan dalaman total (TIRFM) ialah teknik yang menggunakan gelombang pendarfluor yang dijana oleh pancaran cahaya yang merambat antara dua media indeks biasan yang berbeza untuk menyiasat permukaan sel hidup berlabel pendarfluor. Dalam amalan, apabila pancaran laser kejadian bertemu antara muka antara penutup dan medium akueus yang mengandungi sel, ia dipantulkan pada sudut genting (jumlah pantulan dalaman). Kerana tenaga gelombang evanescent berkurangan secara eksponen dengan jarak dari coverlip, hanya fluorofor dalam lingkungan 10 nanometer permukaan (antara 10 dan 200 nanometer) teruja oleh gelombang evanescent, manakala fluorofor yang lebih jauh sebahagian besarnya tidak teruja. Terjejas. Oleh itu, TIRFM menghasilkan paras isyarat yang tinggi daripada fluorofor yang terletak berhampiran penutup penutup, ditindih pada latar belakang yang sangat gelap, memberikan nisbah isyarat-ke-bunyi yang sangat baik. Had kedalaman pengujaan yang melampau adalah sesuai untuk mengkaji molekul tunggal atau komposisi membran dan organel dalam sel melekat berhampiran permukaan penutup (lihat Rajah 8(e)). Memandangkan pengujaan dihadkan kepada kawasan nipis berhampiran slip penutup, pelunturan foto dan fototoksisiti juga terhad kepada kawasan ini, menjadikan TIRFM salah satu kaedah yang paling berguna untuk pemerhatian jangka panjang. Teknik ini telah menjadi alat asas untuk mengkaji pelbagai fenomena dalam biologi sel dan molekul.
Dekonvolusi ialah algoritma yang digunakan pada set imej semua fokus yang diperoleh sepanjang paksi optik (Z) untuk meningkatkan isyarat foton dalam timbunan imej untuk satah imej tertentu atau satah fokus berbilang. Mikroskop mesti dilengkapi dengan pemacu fokus bermotor berketepatan tinggi untuk menjamin pemerolehan imej pada selang waktu yang ditetapkan dengan tepat antara satah fokus sampel. Dalam aplikasi biasa (lihat Rajah 8(f)), proses penyahkonvolusian digunakan untuk menyahkaburkan dan mengeluarkan cahaya tidak fokus daripada satah fokus tertentu menggunakan pengujaan dan pancaran pendarfluor medan lebar. Aplikasi yang paling kompleks ialah menggunakan proses penyahkonvolusian pada keseluruhan timbunan imej untuk menjana paparan unjuran atau model 3D. Satu set imej medan lebar yang digunakan untuk penyahkonvolusian menangkap bilangan maksimum teori foton yang dipancarkan oleh sampel. Proses dekonvolusi mengagihkan semula keamatan "kabur" foton yang dipancarkan di atas dan di bawah satah fokus kembali ke satah asal. Oleh itu, penyahkonvolusian menggunakan hampir semua keamatan pelepasan yang tersedia dan menyediakan belanjawan cahaya yang optimum, menjadikan teknik ini kaedah pilihan untuk sampel yang sangat sensitif cahaya.
Varian fenomena pemindahan tenaga resonans pada mikroskop pendarfluor, pendarfluor atau pemindahan tenaga resonans Förster (FRET) digunakan untuk mendapatkan maklumat temporal dan spatial kuantitatif tentang pengikatan dan interaksi protein, lipid, enzim dan asid nukleik dalam sel hidup. FRET boleh menggunakan sama ada teknik keadaan malar atau penyelesaian masa, tetapi pengimejan FRET yang diselesaikan masa mempunyai kelebihan untuk memetakan jarak penerima penderma dengan lebih tepat. Mikroskop pendarfluor medan lebar standard yang dilengkapi dengan penapis pengujaan dan pelepasan yang sesuai serta kamera sensitif boleh digunakan untuk pengimejan FRET. Biosensor yang mengapit protein atau peptida yang sensitif terhadap alam sekitar antara dua protein pendarfluor yang boleh digunakan FRET sedang digunakan secara meluas dalam biologi sel. Probe ini mudah diimej di bawah mikroskop pendarfluor medan lebar menggunakan teknik FRET pelepasan terpeka yang digabungkan dengan analisis nisbahmetrik. Selain itu, pengimejan spektrum dan pencampuran linear menggunakan mikroskop confocal pengimbasan laser boleh membantu memantau fenomena FRET dalam biosensor dan aplikasi protein pendarfluor yang lain.
Mikroskopi pengimejan seumur hidup pendarfluor (FLIM) ialah teknik canggih yang mampu merekodkan seumur hidup pendarfluor dan lokasi spatial fluorophore pada setiap lokasi dalam imej secara serentak. Kaedah ini menyediakan mekanisme untuk mengkaji parameter persekitaran seperti pH, kepekatan ionik, kekutuban pelarut, interaksi bukan kovalen, kelikatan, dan ketegangan oksigen dalam sel hidup tunggal dan membentangkan data dalam tatasusunan ruang dan temporal. Pengukuran FLIM bagi jangka hayat keadaan teruja pada skala nanosaat adalah bebas daripada kepekatan fluorofor tempatan, kesan pelunturan foto dan panjang laluan (ketebalan sampel), tetapi sensitif kepada tindak balas keadaan teruja seperti pemindahan tenaga resonans. Malah, menggabungkan FLIM dengan FRET dengan memantau perubahan seumur hidup penderma pendarfluor sebelum dan selepas pemindahan tenaga resonans dianggap sebagai salah satu cara terbaik untuk mengkaji fenomena ini.
Mobiliti (pekali resapan melintang) makromolekul berlabel pendarfluor dan fluorofor kecil boleh ditentukan dengan teknik pemulihan pendarfluor selepas pelunturan foto (FRAP). Dalam FRAP, kawasan terpilih yang sangat kecil (berdiameter beberapa mikrometer) disinari secara intensif, biasanya dengan laser, untuk menghasilkan pelunturan foto sepenuhnya bagi fluorophore di kawasan itu. Hasilnya ialah pengurangan dramatik atau penghapusan pendarfluor. Berikutan nadi pelunturan foto, kadar dan tahap pemulihan intensiti pendarfluor di kawasan terluntur dipantau sebagai fungsi masa pada intensiti pengujaan rendah untuk menjana maklumat tentang kinetik repopulasi dan pemulihan fluorophore (Rajah 9). FRAP biasanya dilakukan menggunakan EGFP atau protein pendarfluor lain. Teknik pengaktifan foto berkaitan adalah berdasarkan fluorofor sangkar sintetik khas atau protein pendarfluor yang berfungsi serupa yang boleh diaktifkan oleh denyut pendek UV atau ungu. Photoactivation dan FRAP boleh digunakan sebagai teknik pelengkap untuk menentukan parameter mobiliti.
Dalam teknik yang berkaitan dengan FRAP, dipanggil kehilangan pendarfluor selepas pelunturan foto (FLIP), kawasan pendarfluor yang ditentukan dalam sel hidup mengalami pelunturan foto berulang melalui penyinaran sengit. Jika semua fluorofor dapat meresap ke kawasan yang sedang dilunturkan dalam tempoh masa yang diukur, ini akan mengakibatkan kehilangan sepenuhnya isyarat pendarfluor di seluruh sel. Dengan mengira kadar di mana pendarfluor hilang dari keseluruhan sel, mobiliti difusi fluorophore sasaran boleh ditentukan. Di samping itu, FLIP boleh dengan mudah mengenal pasti lokasi dan sifat sebarang halangan resapan antara petak individu sel, seperti penghalang antara soma dan akson neuron.
Spektroskopi korelasi pendarfluor (FCS), terutamanya digunakan dalam mikroskop confocal pengimbasan laser atau mikroskop multifoton, ialah kaedah yang direka untuk menentukan maklumat kinetik seperti kadar tindak balas kimia, pekali resapan, Teknik untuk berat molekul, kadar aliran dan pengagregatan. Dalam FCS, isipadu kecil (kira-kira satu femtometer; fokus laser terhad pembelauan) diterangi dengan pancaran laser terfokus untuk merekod turun naik intensiti autofluoresensi yang disebabkan oleh dinamik molekul pendarfluor sebagai fungsi masa dalam isipadu yang diduduki oleh pendarfluor. molekul (Rajah 10). Fluorofor yang agak kecil meresap dengan cepat dalam isipadu yang diterangi, menghasilkan letupan pendek intensiti rawak. Sebaliknya, kompleks yang lebih besar (fluorofor terikat kepada makromolekul) bergerak lebih perlahan, menghasilkan corak intensiti pendarfluor yang bergantung pada masa yang lebih panjang dan berterusan.
Apabila struktur berlabel pendarfluor dibungkus padat dan bertindih di kawasan tertentu sel hidup, dinamik dan taburan spatialnya sukar untuk dianalisis. Mikroskopi titik pendarfluor (FSM) ialah teknik yang serasi dengan hampir semua modaliti pengimejan yang memanfaatkan kepekatan sangat rendah subunit berlabel pendarfluor, mengurangkan pendarfluor tidak fokus dan meningkatkan keterlihatan struktur berlabel dan dinamiknya dalam kawasan tebal. FSM dilaksanakan dengan melabelkan hanya sebahagian kecil daripada keseluruhan struktur kepentingan. Dalam pengertian ini, FSM adalah serupa dengan melaksanakan FCS ke atas keseluruhan bidang pandangan, walaupun ia lebih menekankan pada corak spatial daripada analisis temporal kuantitatif. Mikroskopi titik pendarfluor amat berguna dalam menentukan mobiliti dan pengagregatan unsur sitoskeletal seperti aktin dan mikrotubul dalam sel hiperaktif.
Mikroskopi penyusutan pelepasan terrangsang (STED) ialah teknik peleraian super yang muncul dengan resolusi spatial jauh melebihi had pembelauan, menggunakan cahaya susut berbentuk cincin untuk mengelilingi pancaran cahaya pengujaan yang lebih kecil untuk mendapatkan sub-50 nm pada paksi kepada resolusi. Teknik ini bergantung pada pengujaan fluorofor dengan denyutan laser yang disegerakkan dan denyutan STED bulat yang diselaraskan secara ruang yang menghabiskan cahaya yang dipancarkan, menekan pendarfluor molekul teruja di sekitar fokus pengimbasan laser. Pendarfluor yang dijana di pinggir tempat ditindas, tetapi tidak di tengah tempat, dengan itu mengurangkan dengan ketara saiz tempat pendarfluor dan meningkatkan resolusi dengan ketara. STED telah terbukti sebagai alat yang berguna untuk pengesanan resolusi tinggi sel hidup. Teknik resolusi super baru muncul, seperti mikroskop penyetempatan fotoaktif (PALM) dan mikroskop pencahayaan cahaya berstruktur (SIM), juga akan menjadi alat asas untuk pengimejan sel hidup dalam masa terdekat.
Peningkatan penggunaan protein pendarfluor yang dikodkan secara genetik dan fluorofor sintetik termaju untuk pengimejan sel hidup membuka pintu kepada modaliti optik baharu untuk memantau dinamik temporal dan perhubungan spatial. Mikroskop kini mempunyai satu set alat lengkap untuk memerhati dan merekod data imej proses selular yang berlaku dalam pelbagai skala masa dan pada resolusi berbilang. Peristiwa yang lebih perlahan boleh diperhatikan dan direkodkan dengan mudah menggunakan mikroskopi konfokal pengimbasan laser, manakala peristiwa kinetik yang lebih pantas boleh diperoleh menggunakan teknologi cakera berputar. Di samping itu, mikroskop multifoton membolehkan pengimejan dalam dalam tisu tebal, dan teknik pantulan dalaman menyeluruh membolehkan pemeriksaan permukaan membran dengan ketepatan confocal. Kaedah pendarfluor lanjutan, seperti FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM dan STED, boleh digunakan untuk memantau interaksi protein-protein pada resolusi selalunya lebih baik daripada yang dibenarkan oleh had pembelauan. Dengan kemajuan dalam teknologi fluorofor, mikroskop dan pengesan, dunia yang lebih luas akan dibawa "di bawah mikroskop".
