Pengimejan mikroskopi multifoton: pelbagai teknik untuk pengimejan neuron dalam vivo
Berbanding dengan mikroskop pendarfluor medan lebar satu foton tradisional, mikroskop multifoton (MPM) mempunyai fungsi keratan optik dan pengimejan dalam. Pada 2019, Jerome Lecoq et al. membincangkan teknologi MPM berkaitan dari tiga aspek: pengimejan neuron jauh di dalam otak, pengimejan neuron besar-besaran, dan pengimejan neuron berkelajuan tinggi.
Untuk menghubungkan aktiviti neuron dengan tingkah laku yang kompleks, biasanya diperlukan untuk imej neuron dalam korteks dalam, yang memerlukan MPM mempunyai keupayaan pengimejan dalam. Cahaya pengujaan dan pancaran akan sangat bertaburan dan diserap oleh tisu biologi, yang merupakan faktor utama yang mengehadkan kedalaman pengimejan MPM. Walaupun masalah taburan boleh diselesaikan dengan meningkatkan keamatan laser, ia akan membawa masalah lain, seperti membakar sampel, nyahfokus dan pengujaan Pendarfluor berhampiran permukaan. Cara terbaik untuk meningkatkan kedalaman pengimejan MPM ialah menggunakan panjang gelombang yang lebih panjang sebagai cahaya pengujaan.
Di samping itu, untuk pengimejan dua foton (2P), pengujaan luar fokus dan pendarfluor dekat permukaan adalah dua faktor pengehad kedalaman terbesar, manakala untuk pengimejan tiga foton (3P), kedua-dua masalah ini dikurangkan dengan ketara, tetapi pengimejan tiga foton akibat pendarfluor Keratan rentas serapan kumpulan adalah jauh lebih kecil daripada 2P, jadi susunan magnitud tenaga nadi yang lebih tinggi diperlukan untuk mendapatkan isyarat pendarfluor intensiti yang sama seperti yang diuja oleh 2P. Mikroskopi 3P berfungsi lebih menuntut daripada mikroskopi 3P struktur, yang memerlukan pengimbasan lebih pantas untuk mencuba aktiviti neuron dalam masa; tenaga nadi yang lebih tinggi diperlukan untuk mengumpul isyarat yang mencukupi dalam masa tinggal setiap piksel.
Tingkah laku yang kompleks selalunya melibatkan rangkaian otak yang besar dengan kedua-dua sambungan tempatan dan jarak jauh. Untuk menghubungkan aktiviti neuron dengan tingkah laku, adalah perlu untuk memantau aktiviti neuron yang sangat besar dan diedarkan secara meluas pada masa yang sama. Rangkaian saraf dalam otak memproses rangsangan masuk dalam masa berpuluh-puluh milisaat. Untuk memahami rangkaian neural yang pantas ini Untuk mengkaji dinamik neuron, MPM dikehendaki mempunyai keupayaan untuk imej neuron dengan pantas. Kaedah MPM pantas boleh dibahagikan kepada teknik pengimbasan pancaran tunggal dan teknik pengimbasan pancaran berbilang.
Teknologi imbasan rasuk tunggal membolehkan traversal tisu saraf berkelajuan tinggi dengan medan pandangan yang besar (FOV)
Apabila menggunakan MPM untuk imej neuron, pengimbasan akses rawak—iaitu, pancaran laser diimbas dengan cepat pada mana-mana titik terpilih pada keseluruhan medan pandangan—hanya boleh mengimbas neuron yang diminati, yang bukan sahaja mengelakkan pengimbasan mana-mana gentian Saraf yang tidak berlabel boleh juga mengoptimumkan masa pengimbasan pancaran laser. Pengimbasan akses rawak (Rajah 1) boleh dicapai dengan deflektor acousto-optik (AOD), yang berfungsi dengan mengikat transduser piezoelektrik dengan isyarat frekuensi radio kepada kristal yang sesuai. Gelombang akustik yang terhasil mendorong kisi indeks biasan berkala, Pembelauan berlaku apabila pancaran laser melalui parut. Keamatan dan kekerapan gelombang bunyi boleh diselaraskan oleh isyarat elektrik frekuensi radio untuk menukar keamatan dan arah cahaya yang difraksi, supaya pengimbasan titik sewenang-wenang mendatar satu dimensi boleh direalisasikan dengan menggunakan satu AOD, dan 3D boleh direalisasikan dengan menggunakan sepasang AOD digabungkan dengan teknologi pengimbasan paksi lain pengimbasan akses rawak. Walau bagaimanapun, teknik ini sangat sensitif terhadap gerakan sampel dan terdedah kepada artifak gerakan. Pada masa ini, pengimbasan raster pantas, iaitu pengimbasan progresif dalam FOV, digunakan secara meluas kerana algoritma boleh menyelesaikan artifak gerakan dengan mudah.
Pengimejan dua foton berasaskan AOD bagi neuron L2/3 neokortikal dalam vivo[2]
Terdapat banyak cara untuk merealisasikan pengimbasan raster pantas, menggunakan cermin bergetar untuk pengimbasan 2D pantas, menggabungkan cermin bergetar dan kanta elektrik boleh laras untuk pengimbasan 3D pantas, tetapi kanta elektrik boleh laras tidak boleh memfokus dengan cepat ke arah paksi kerana had Pensuisan inersia mekanikal, yang menjejaskan kelajuan pengimejan, kini boleh digantikan dengan modulator cahaya spatial (SLM).
Pemfokusan jauh juga merupakan cara untuk mencapai pengimejan 3D, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2. Dalam modul LSU, galvanometer pengimbasan mengimbas secara mendatar, dan modul ASU termasuk kanta objektif L1 dan cermin M, dan pengimbasan paksi direalisasikan dengan melaraskan kedudukan M. Teknik ini bukan sahaja boleh membetulkan penyimpangan optik yang diperkenalkan oleh kanta objektif utama L2, tetapi juga membolehkan pengimbasan paksi pantas. Untuk mendapatkan lebih banyak pengimejan neuron, FOV boleh diperbesarkan dengan melaraskan reka bentuk kanta objektif mikroskop, tetapi kanta objektif dengan NA besar dan FOV besar biasanya berat dan tidak boleh bergerak dengan cepat untuk pengimbasan paksi pantas, sistem FOV yang besar bergantung pada Telefocus. , SLM dan kanta bermotor boleh laras.
Gambarajah skematik sistem pengimejan dua foton pemfokusan jauh[3] Teknologi pengimbasan berbilang rasuk boleh secara serentak menggambarkan kedudukan tisu neuron yang berbeza
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 mm antara) tapak pengimejan (Rajah 3C,D); untuk kawasan bersebelahan, ia biasanya menggunakan berbilang rasuk bagi kanta objektif tunggal untuk pengimejan (Rajah 3E, F). Teknik pengimbasan berbilang rasuk mesti memberi perhatian khusus kepada masalah crosstalk antara rasuk pengujaan, yang boleh diselesaikan dengan kaedah pemisahan sumber pasca cahaya atau kaedah pemultipleksan ruang-masa. Kaedah pemisahan sumber cahaya post-hoc merujuk kepada penggunaan algoritma untuk memisahkan rasuk untuk menghapuskan crosstalk; kaedah pemultipleksan ruang masa merujuk kepada penggunaan serentak pelbagai rasuk pengujaan, denyutan setiap rasuk ditangguhkan dalam masa, supaya rasuk individu teruja oleh rasuk yang berbeza boleh dipisahkan buat sementara waktu. isyarat pendarfluor. Lebih banyak neuron boleh digambarkan dengan memperkenalkan lebih banyak rasuk, tetapi berbilang rasuk akan meningkatkan pertindihan masa pereputan pendarfluor, yang mengehadkan keupayaan untuk membezakan sumber isyarat; dan pemultipleksan mempunyai kesan negatif terhadap kelajuan kerja peranti elektronik. Keperluan tinggi; sejumlah besar rasuk juga memerlukan kuasa laser yang lebih tinggi untuk mengekalkan anggaran nisbah isyarat-ke-bunyi bagi satu rasuk, yang boleh menyebabkan kerosakan tisu dengan mudah.
Teknologi Pengimejan Kawasan Besar
Dalam tahun-tahun kebelakangan ini, perkembangan teknologi MPM yang berbeza telah meluaskan skop pengimejan tisu saraf kami, membolehkan kami menggambarkan lebih banyak neuron jauh di dalam otak pada kelajuan yang lebih pantas, yang telah menggalakkan penyelidikan neurosains dan membolehkan kami Mendapat pemahaman yang lebih jelas. daripada fungsi otak.
