Teknik pewarnaan dan pemerhatian mikroskopik mikro-organisma
1. Tujuan
1.1 Mempelajari teknik asas calitan dan pewarnaan mikrob.
1.2 Menguasai kaedah pewarnaan mudah bakteria.
1.3 Memahami secara awal ciri-ciri morfologi bakteria, dan menyatukan pengetahuan tentang cara menggunakan kanta minyak dan teknik operasi aseptik.
2 Prinsip
Calitan dan pewarnaan bakteria adalah teknik asas dalam eksperimen mikrobiologi. Sel-sel bakteria adalah kecil dan telus, menjadikannya sukar untuk dikenal pasti di bawah mikroskop cahaya biasa; mereka mesti dinodai. Satu pewarna digunakan untuk mewarna bakteria, supaya bakteria yang diwarnakan membentuk perbezaan warna yang jelas dari latar belakang, supaya morfologi dan strukturnya dapat diperhatikan dengan lebih jelas. Kaedah ini mudah dikendalikan dan sesuai untuk memerhatikan bentuk umum sel bakteria dan susunan bakteria. Pewarna asas biasanya digunakan untuk pewarnaan mudah. Ini kerana dalam larutan neutral, beralkali atau berasid lemah, sel bakteria biasanya bercas negatif, dan apabila pewarna asas diionkan, bahagian pencelupan molekulnya bercas positif, jadi ia beralkali. Bahagian pewarnaan pewarna mudah bergabung dengan bakteria untuk mewarnakannya. Sel-sel bakteria yang diwarnai berbeza secara mendadak dengan latar belakang, menjadikannya lebih mudah untuk dikenal pasti di bawah mikroskop. Pewarna yang biasa digunakan untuk pencelupan ringkas termasuk biru metilena, ungu kristal, fuchsin asas, dll. Apabila bakteria mengurai gula dan menghasilkan asid, menyebabkan pH medium kultur menurun, cas positif pada bakteria meningkat. Pada masa ini, pewarna berasid seperti eosin, asid fuchsin, atau merah Congo boleh digunakan untuk pewarnaan. Bakteria mesti diperbaiki sebelum pewarnaan. Ia mempunyai dua tujuan: satu adalah untuk membunuh bakteria dan membuatnya melekat pada slaid kaca; yang lain adalah untuk meningkatkan pertalian mereka terhadap pewarna. Dua kaedah yang biasa digunakan ialah pemanasan dan penetapan kimia. Apabila membetulkan, cuba mengekalkan bentuk asal sel.
3 bahan
3.1 Bakteria: Bacillus subtilis 12-18h kultur slant agar nutrient, Staphylococcus aureus 24h nutrient agar slant kultur, Escherichia coli 24h nutrient agar slant kultur, baker's yeast agar agar slant.
3.2 Agen pewarna: Pewarna biru metilena alkali Lu (atau pewarna ungu kristal ammonium oksalat), pewarna fuchsin asid karbolik.
3.3 Alat atau perkakas lain: mikroskop, lampu alkohol, slaid, gelung inokulasi, rak slaid, botol dua lapis (mengandungi minyak cedar dan xilena), tisu kanta, masin fisiologi atau air suling, dsb.
4. Proses: sapuan → pengeringan → penetapan → pewarnaan → pencucian → pengeringan → pemeriksaan mikroskopik.
5 langkah
5.1 Calitan: Ambil dua slaid kaca bersih dan bebas minyak. Dalam keadaan steril, letakkan setitik kecil garam biasa (atau air suling) pada setiap tengah slaid kaca. Gunakan gelung inokulasi untuk mensterilkan bakteria daripada Bacillus subtilis. , Micrococcus luteus dan Escherichia coli, petik sedikit rumput bakteria dalam titisan air pada senget, gaul rata dan sapukan ke dalam filem nipis. Jika anda menggunakan sapuan ampaian bakteria (atau kultur cecair), anda boleh menggunakan gelung inokulasi untuk memilih 2 hingga 3 gelung dan sapukan terus pada slaid. Berhati-hati untuk tidak menjatuhkan terlalu banyak garam fisiologi (air suling) dan membuang bakteria dan sapukannya secara merata dan tidak terlalu tebal.
5.2 Pengeringan Keringkan secara semula jadi pada suhu bilik. Anda juga boleh memanaskannya sedikit di atas lampu alkohol dengan bahagian bersalut menghadap ke atas untuk mengeringkannya. Tetapi pastikan anda tidak terlalu dekat dengan nyalaan, kerana suhu yang terlalu tinggi akan memusnahkan morfologi bakteria.
5.3 Penetapan Jika pengeringan yang dipanaskan digunakan, penetapan dan pengeringan digabungkan menjadi satu langkah, dan kaedahnya adalah sama seperti pengeringan. Calit, keringkan dan betulkan haba.
5.4 Pewarnaan: Letakkan slaid rata di atas rak slaid, dan tambah 1 hingga 2 titis larutan pewarna ke atas smear (adalah sesuai untuk larutan pewarna hanya menutup filem smear). Warnakan dengan metilena biru asas Lu selama 1 hingga 2 minit, dan warnakan dengan asid karbolik fuchsin (atau ungu kristal ammonium oksalat) selama kira-kira 1 minit.
5.5 Mencuci dengan air: Tuangkan larutan pewarna dan bilas perlahan-lahan dengan air paip dari satu hujung slaid sehingga air yang mengalir turun dari sapuan tidak berwarna. Apabila mencuci dengan air, jangan basuh permukaan bersalut terus dengan air. Aliran air tidak boleh terlalu laju atau terlalu besar untuk mengelakkan filem sapuan daripada jatuh.
5.6 Pengeringan: Goncangkan titisan air pada slaid dan keringkan secara semula jadi, keringkan dengan pengering rambut atau serap dengan kertas penyerap (berhati-hati agar tidak menghapuskan bakteria). 5.7 Pemeriksaan mikroskopik Selepas smear kering, lakukan pemeriksaan mikroskopik. Calitan mesti kering sepenuhnya sebelum dilihat dengan kanta minyak.
6 Keputusan Lukiskan morfologi E. coli dan Micrococcus luteus yang diperhatikan selepas pewarnaan tunggal.
