Ciri teknikal dan kemahiran penggunaan mikroskop pendarfluor dua foton
Mikroskopi pendarfluor dua foton ialah teknologi baharu yang menggabungkan mikroskopi konfokal pengimbasan laser dan teknologi pengujaan dua foton.
Prinsip asas pengujaan dua foton ialah: dalam kes ketumpatan foton yang tinggi, molekul pendarfluor boleh menyerap dua foton panjang gelombang panjang pada masa yang sama, dan memancarkan foton panjang gelombang yang lebih pendek selepas tempoh singkat yang dipanggil seumur hidup keadaan teruja. . ; Kesannya adalah sama seperti menggunakan foton dengan panjang gelombang separuh panjang gelombang panjang untuk merangsang molekul pendarfluor. Pengujaan dua foton memerlukan ketumpatan foton yang tinggi. Untuk tidak merosakkan sel, mikroskop dua foton menggunakan laser berdenyut terkunci mod tenaga tinggi. Laser yang dipancarkan oleh laser ini mempunyai tenaga puncak yang tinggi dan tenaga purata yang rendah, lebar nadinya hanya 100 femtosaat, dan tempohnya boleh mencapai 80 hingga 100 megahertz. Apabila menggunakan kanta objektif apertur berangka tinggi untuk memfokuskan foton laser berdenyut, ketumpatan foton pada titik fokus kanta objektif adalah yang tertinggi, dan pengujaan dua foton hanya berlaku pada titik fokus kanta objektif, jadi mikroskop dua foton tidak memerlukan lubang jarum confocal, yang meningkatkan kecekapan pengesanan Pendarfluor. Ia merupakan kaedah penyelidikan yang penting dalam bidang morfologi, biologi sel molekul, neurosains, dan farmakologi.
1. Latar belakang kemunculan mikroskop dua foton - dua batasan mikroskop confocal laser tradisional:
1) Salah satunya ialah fenomena fototoksisiti: kerana lubang jarum confocal mestilah cukup kecil untuk mendapatkan imej resolusi tinggi, dan apertur kecil akan menyekat sebahagian besar pendarfluor yang dipancarkan daripada sampel, termasuk pendarfluor yang dipancarkan dari satah fokus, yang sepadan Ya, cahaya pengujaan mestilah cukup kuat untuk mendapatkan nisbah isyarat-ke-bunyi yang mencukupi; dan laser intensiti tinggi akan menyebabkan pewarna pendarfluor pudar dengan cepat semasa pengimbasan berterusan, dan isyarat pendarfluor akan menjadi lebih lemah dan lebih lemah apabila pengimbasan berlangsung.
2) Ketoksikan foto adalah satu lagi masalah. Di bawah penyinaran laser, banyak molekul pewarna pendarfluor akan menghasilkan sitotoksin seperti oksigen singlet atau radikal bebas, jadi masa pengimbasan dan ketumpatan kuasa optik cahaya pengujaan harus dihadkan dalam eksperimen untuk mengekalkan ketumpatan sampel. aktif. Dalam penyelidikan ke atas sampel aktif, terutamanya pelbagai peringkat pertumbuhan dan perkembangan sampel aktif, pemutihan foto dan fototoksisiti menjadikan kajian ini sangat terhad.
2. Mengapakah anda mengatakan bahawa mikroskop dua foton secara amnya tidak perlu dilengkapi dengan laser pengujaan ultraviolet?
Mikroskopi dua foton ialah teknologi pengujaan pendarfluor berdasarkan kesan pengujaan dua foton: molekul pewarna pendarfluor boleh teruja dengan menyerap dua foton tenaga rendah pada masa yang sama (selang masa antara dua foton mencapai molekul pendarfluor kurang daripada 1 femtosaat ), kesan pengujaannya boleh sama dengan menyerap foton bertenaga tinggi 1/2 panjang gelombang. Sebagai contoh, menyerap dua foton pada panjang gelombang merah adalah bersamaan dengan molekul yang menyerap ultraungu. Foton bergelombang panjang tidak mudah diserap oleh sel, jadi fototoksisiti kepada sel hidup berkurangan, dan pelunturan foto juga berkurangan. Dengan cara ini, ia bukan sahaja memainkan fungsi pengujaan ultraviolet, tetapi juga mengelakkan kerosakan cahaya ultraviolet kepada sampel.
3. Apakah keistimewaan laser mikroskop dua foton?
Kebarangkalian penyerapan dua foton bergantung pada seberapa rapat dua foton kejadian bertepatan dalam ruang dan masa (dua foton mesti tiba dalam 10-18 saat). Keratan rentas serapan dua foton adalah kecil, dan hanya fluorofor di kawasan yang mempunyai fluks foton besar yang teruja. Oleh itu, kebanyakan laser yang digunakan ialah laser nilam titanium, yang boleh mencapai kelajuan pengimbasan picosecond atau femtosecond, dan mempunyai kuasa puncak yang sangat tinggi dan kuasa purata yang rendah, supaya photobleaching dan phototoxicity dapat dikurangkan atau dihapuskan. Perkara yang paling penting ialah menyediakan ketumpatan foton yang sangat tinggi dalam julat yang kecil, yang boleh memastikan pengujaan serentak dua foton.
4. Apakah kelebihan pengujaan dua foton?
1) Tingkatkan selektiviti pewarna: julat cahaya pengujaan laser sistem confocal (Ar, Ar/Kr, HeNe) ialah 488nm - 647nm. Ini bermakna bereksperimen dengan pewarna pendarfluor yang teruja UV, cth dengan DAPI , Hoescht. Panjang gelombang pengujaan dua foton adalah dua kali ganda daripada foton tunggal, jadi pewarna yang teruja oleh ultraviolet boleh teruja oleh cahaya inframerah dekat.
2) Kurangkan pelunturan foto: Kerana pengurangan dalam pelunturan foto, kadar kejayaan eksperimen menggunakan CFP/YFP untuk pemindahan tenaga resonans pendarfluor (FRET) meningkat.
3) Tiada kanta objektif khas diperlukan: Dari sudut perkakasan, pengujaan pewarna UV-teruja dengan panjang gelombang cahaya inframerah hampir tidak memerlukan komponen optik UV khas.
4) Tingkatkan nisbah isyarat kepada hingar: panjang gelombang cahaya pengujaan dan panjang gelombang cahaya yang dipancarkan mempunyai perbezaan yang besar, yang meningkatkan nisbah isyarat kepada hingar.
5) Pelunturan disetempatkan ke titik fokus: Memandangkan pengujaan pendarfluor berlaku hanya pada titik fokus objektif, tidak ada keperluan untuk lubang jarum confocal. Ini meningkatkan pengesanan cahaya dan pelunturan foto berlaku hanya pada titik fokus.
6) Lebih mudah untuk menembusi spesimen: Cahaya panjang gelombang inframerah tidak mudah diserakkan oleh sel dan boleh menembusi spesimen yang lebih dalam.
5. Berbanding dengan mikroskopi confocal pengimbasan laser, apakah peningkatan terbesar yang dibuat oleh mikroskop dua foton?
1) Mengurangkan pelunturan foto.
2) Ketoksikan foto dikurangkan.
3) Ia tidak mudah untuk berselerak, dan lebih mudah untuk menembusi sampel tebal, seperti hirisan otak.
