Perbezaan antara mikroskop pendarfluor (dua foton, confocal) dan mikroskop biasa
Prinsip asas pengujaan dua foton ialah pada ketumpatan foton yang tinggi, molekul pendarfluor secara serentak menyerap dua foton panjang gelombang panjang dan memancarkan foton panjang gelombang yang lebih pendek selepas tempoh yang singkat yang dipanggil seumur hidup negara yang teruja; Kesannya adalah sama seperti menggunakan foton dengan separuh panjang gelombang panjang gelombang panjang untuk merangsang molekul pendarfluor. Dua pengujaan foton memerlukan ketumpatan foton yang tinggi, dan untuk mengelakkan sel-sel yang merosakkan, mikroskopi dua foton menggunakan laser nadi yang dikunci mod tinggi. Laser yang dipancarkan oleh laser ini mempunyai tenaga puncak yang tinggi dan tenaga purata yang rendah, dengan lebar nadi hanya 100 femtoseconds dan kekerapan sehingga 80 hingga 100 megahertz. Apabila menggunakan lensa objektif apertur yang tinggi untuk memfokuskan foton laser berdenyut, ketumpatan foton pada titik fokus lensa objektif adalah pengujaan tertinggi, dan dua foton hanya berlaku pada titik fokus lensa objektif. Oleh itu, mikroskop dua-foton tidak memerlukan lubang pinal konflik, yang meningkatkan kecekapan pengesanan pendarfluor.
Secara fenomena pendarfluor umum, disebabkan oleh ketumpatan foton rendah cahaya pengujaan, molekul pendarfluor hanya boleh menyerap satu foton pada satu masa dan kemudian memancarkan satu lagi foton pendarfluor melalui peralihan radiasi, yang dikenali sebagai pendarfluor foton tunggal. Untuk proses pengujaan pendarfluor menggunakan laser sebagai sumber cahaya, fenomena pendarfluor dua foton atau bahkan multiphoton mungkin berlaku. Dalam kes ini, sumber cahaya pengujaan yang digunakan mempunyai intensiti tinggi dan ketumpatan foton yang memenuhi keperluan untuk molekul pendarfluor untuk menyerap dua foton secara serentak. Dalam proses menggunakan laser umum sebagai sumber cahaya pengujaan, ketumpatan foton masih tidak mencukupi untuk menghasilkan fenomena penyerapan dua foton. Biasanya, laser nadi femtosecond digunakan, dengan kuasa seketika mencapai tahap megawatt. Oleh itu, panjang gelombang pendarfluor dua foton adalah lebih pendek daripada cahaya pengujaan, bersamaan dengan kesan yang dihasilkan oleh pengujaan panjang gelombang pengujaan separuh.
Pengetahuan yang berkaitan dengan mikroskopi pendarfluor konflik
Prinsip asas mikroskopi pendarfluor confocal adalah menggunakan sumber cahaya titik untuk menyinari spesimen, membentuk tempat cahaya kecil yang jelas pada satah fokus. Pendarfluor yang dipancarkan dari tempat ini selepas penyinaran dikumpulkan oleh lensa objektif dan dihantar kembali sepanjang laluan penyinaran asal ke splitter rasuk yang terdiri daripada cermin dichroic. Spektrometer menghantar pendarfluor terus ke pengesan. Terdapat lubang di hadapan kedua -dua sumber cahaya dan pengesan, yang dipanggil Pinhole Pencahayaan dan Pinhole Pengesanan, masing -masing. Dimensi geometri kedua -dua adalah konsisten, kira -kira 100-200 nm; Berbanding dengan tempat cahaya pada satah fokus, kedua -duanya adalah konjugasi, yang bermaksud bahawa tempat cahaya melewati satu siri kanta dan akhirnya boleh memberi tumpuan kepada kedua -dua lubang pencahayaan dan pengesanan pinhole secara serentak. Dengan cara ini, cahaya dari satah fokus boleh berkumpul di dalam julat lubang pengesanan, sementara cahaya bertaburan dari atas atau di bawah satah fokus disekat di luar lubang pengesanan dan tidak dapat dicatatkan. Mengimbas titik sampel dengan titik dengan laser, tiub photomultiplier selepas mengesan lubang pin juga memperoleh imej confocal yang sepadan dengan titik cahaya titik demi titik, mengubahnya menjadi isyarat digital dan menghantarnya ke komputer, dan akhirnya mengagregatkannya ke dalam imej konfok yang jelas dari keseluruhan satah fokal pada skrin.
