Perbezaan antara kontras fasa positif dan negatif dalam mikroskop
Bergantung pada konfigurasi dan sifat gelang fasa yang diletakkan pada satah fokus belakang objektif, sampel boleh diperhatikan dalam kontras fasa positif atau negatif. Tutorial interaktif ini mengkaji hubungan antara sekeliling (S), pembelauan (D), dan zarah terang yang terhasil (gelombang P), serta mikroskopi kontras fasa positif dan negatif. Di samping itu, geometri plat fasa dan imej sampel perwakilan juga dibentangkan.
Apabila orang menggunakannya dalam kerja mereka sekarang, kebanyakan penyelidik berada dalam perbezaan negatif, dan kini perbezaan positif tidak memainkan banyak peranan dalam kerja penyelidikan saintifik semasa.
Tutorial ini memulakan imej fasa dengan sampel yang dipilih secara rawak yang muncul dalam tetingkap Imej Kontras Fasa, dan hubungan gelombang yang sepadan ditunjukkan dalam jiran kiri tetingkap imej. Untuk mengendalikan tutorial, gunakan kursor tetikus untuk mengalihkan terjemahan antara kontras fasa positif dan negatif atau peluncur mod kontras fasa pencahayaan terang. Apabila peluncur diterjemahkan, imej yang muncul dalam tetingkap imej kontras fasa mengubah cara spesimen muncul dalam mod pengimejan semasa yang ditetapkan oleh peluncur. Juga, di bawah graf bentuk gelombang terdapat plat fasa yang berubah bentuk untuk dipadankan dengan mod pengimejan yang dipilih oleh peluncur. Untuk melihat sampel baharu, gunakan menu lungsur Sampel Terpilih untuk memilih sampel lain.
Plot konfigurasi plat fasa, hubungan gelombang dan vektor yang dikaitkan dengan penjanaan imej kontras fasa positif dan negatif ditunjukkan dalam Rajah 1. Contoh spesimen yang diimejkan oleh teknik ini juga ditunjukkan. Dalam konfigurasi optik kontras fasa positif (baris atas imej dalam Rajah 1), muka depan gelombang sekeliling (S) melalui plat fasa, menghasilkan anjakan fasa bersih 180 darjah kemaraan fasa, sebanyak 1/4 panjang gelombang ( 1 separuh panjang gelombang). Muka gelombang sekeliling termaju kini boleh mengambil bahagian dalam gangguan merosakkan dengan gelombang terbeza (D) pada satah imej perantaraan. Dalam kebanyakan kes, hanya memajukan fasa relatif muka gelombang sekeliling sahaja tidak mencukupi untuk menghasilkan penjanaan imej kontras tinggi dalam mikroskop Nikon. Ini adalah kerana amplitud gelombang sekeliling adalah jauh lebih besar daripada gelombang difraksi, dan menekan imej yang terhasil yang dihasilkan oleh gangguan daripada sebahagian kecil daripada jumlah gelombang. Untuk mengurangkan muka gelombang sekeliling kepada nilai yang lebih dekat dengan amplitud gelombang terbeza (dan melakukan gangguan dalam satah imej), kelegapan dalam gelang fasa objektif diperolehi dengan menggunakan logam separa lutsinar (ketumpatan yang semakin meningkat neutral ) salutan Lantai. Gelombang cahaya di sekeliling, yang melalui hampir sepenuhnya melalui gelang fasa mengikut reka bentuk, di bawah mikroskop kontras fasa, dikurangkan dengan ketara dalam amplitud oleh kelegapan plat fasa kepada nilai dalam julat 10 hingga 30 peratus daripada keamatan asal.
Oleh kerana gelombang zarah yang terhasil dihasilkan oleh gangguan* muka gelombang di sekeliling dan difraksi, amplitud gelombang zarah (P) yang dihasilkan oleh gangguan antara muka gelombang yang tiba pada satah imej kini jauh lebih kecil daripada yang di sekeliling apabila dalam Seksual. salutan ketumpatan digunakan. Kesan bersih adalah untuk menukar perbezaan fasa relatif yang diperkenalkan oleh laluan cahaya yang muncul dari satah imej melalui spesimen kepada perbezaan amplitud (intensiti). Oleh kerana mata manusia akan mentafsir perbezaan keamatan sebagai kontras, spesimen kini boleh dilihat dalam kanta mata mikroskop dan juga boleh ditangkap pada membran dengan sistem kamera konvensional, atau secara digital, menggunakan peranti CCD atau CMOS. Semua sistem kontras fasa positif secara selektif memajukan fasa surround (S)-gelombang linear berbanding hadapan gelombang terbeza sfera (D). Spesimen dengan indeks biasan yang lebih tinggi daripada medium sekeliling kelihatan lebih gelap pada latar belakang kelabu neutral, manakala mereka yang mempunyai indeks biasan yang lebih rendah daripada medium renang kelihatan lebih cerah daripada latar belakang kelabu.
Untuk mengubah suai pemisahan spatial bagi muka gelombang terbeza yang mengelilingi fasa dan amplitud dalam sistem optik kontras fasa, beberapa konfigurasi plat fasa telah diperkenalkan. Oleh kerana plat fasa terletak pada atau sangat dekat dengan satah fokus belakang objektif (satah pembelauan) semua cahaya yang melalui mikroskop mesti bergerak melalui komponen ini. Bahagian plat fasa dalam fokus anulus kondensernya dipanggil rantau konjugat, manakala kawasan selebihnya dipanggil rantau pelengkap. Rantau konjugat mengandungi bahan yang bertanggungjawab untuk menukar fasa cahaya sekeliling (tidak terbias) sama ada tambah atau tolak 90 darjah berkenaan dengan muka gelombang terbeza. Secara umum, kawasan gelang fasa-konjugat adalah lebih luas (kira-kira 25 peratus ) daripada kawasan yang ditakrifkan oleh imej gelang pemeluwapan untuk mengurangkan jumlah cahaya sekeliling yang merambat ke kawasan pelengkap.
Kebanyakan plat fasa yang tersedia daripada pengeluar mikroskop moden adalah salah satu daripada yang disediakan melalui pemendapan vakum filem dielektrik dan logam nipis pada plat kaca atau dipasang terus pada permukaan kanta objektif mikroskop. Peranan filem dielektrik adalah untuk fasa cahaya, manakala filem logam melemahkan keamatan cahaya tidak difraksi. Sesetengah pengeluar menggunakan pelbagai salutan anti-pantulan digabungkan dengan filem untuk mengurangkan jumlah silau dan pantulan cahaya sesat kembali ke dalam sistem optik. Jika plat fasa tidak terbentuk pada permukaan kanta, ia biasanya disimen antara kanta berturut-turut yang berada pada satah fokus berhampiran belakang objektif. Ketebalan dan indeks biasan salutan dielektrik, logam, dan antipantulan, serta simen optik, dipilih dengan teliti untuk menghasilkan anjakan fasa yang dikehendaki antara kawasan pelengkap dan terkonjugasi plat fasa. Dalam istilah optik, plat fasa yang menukar fasa relatif kepada cahaya sekeliling untuk membiaskan cahaya sebanyak 90 darjah (sama ada positif atau negatif) dipanggil plat suku gelombang kerana kesan perbezaan laluan optik padanya.
Gambaran keseluruhan songsang fasa positif ditunjukkan dalam Rajah 1. Plat kontras fasa positif (sebelah kiri Rajah 1) mendorong gelombang sekeliling, sebanyak 1/4 panjang gelombang, disebabkan oleh gelang hakisan dalam plat kaca, yang boleh dikurangkan dengan hantaran atas dalam plat indeks tinggi Laluan fizikal gelombang yang diambil. Oleh kerana interaksi dengan sampel, apabila sinar sampel terbias (D) terencat, perbezaan laluan optik antara gelombang mengelilingi dan terbelau yang muncul daripada plat fasa ialah separuh panjang gelombang sebanyak 1/4 panjang gelombang. Hasil bersih ialah 180-perbezaan laluan optik darjah antara gelombang sekeliling dan gelombang terbeza, yang mengakibatkan gangguan merosakkan untuk sampel indeks biasan tinggi antara satah imej. Lengkung amplitud untuk fasa positif bertentangan gelombang gangguan pemusnah ditunjukkan dalam graf atas Rajah 1. Gelombang zarah (P) yang terhasil mempunyai amplitud yang lebih rendah daripada gelombang sekeliling (S), dengan itu menjadikan objek kelihatan berbanding dengan yang agak latar belakang yang lebih gelap. Bawah, imej alga hijau Zygnema ditunjukkan di sebelah kanan (berlabel DL). Vektor yang diwakili oleh kemajuan 1/4 panjang gelombang, yang ditunjukkan sebagai 90-darjah berputar melawan arah jam gelombang sekeliling dalam kontras fasa positif, muncul di antara rajah dan imej dalam Rajah 1.
Sebagai alternatif, optik mikroskop juga boleh direka untuk menghasilkan fasa negatif yang bertentangan, seperti yang ditunjukkan di bahagian bawah Rajah 1, di mana gelombang sekeliling (S) ditangguhkan (bukannya maju) dengan suku panjang gelombang relatif pada gelombang (D) yang difraksi. Hasilnya, spesimen dengan indeks biasan yang tinggi kelihatan lebih cerah dengan latar belakang kelabu yang lebih gelap (lihat imej bawah berlabel BM dalam Rajah 1). Dalam fasa negatif bertentangan, plat fasa objektif mengandungi gelang terangkat yang melambatkan fasa (daripada memajukan fasa sebagai bertentangan fasa positif), melepasi suku panjang gelombang berbanding fasa gelombang difraksi sebagai gelombang sekeliling tertib sifar . Oleh kerana gelombang yang difraksi telah ditangguhkan oleh satu perempat panjang gelombang apabila ia melalui spesimen, perbezaan laluan optik antara gelombang di sekeliling dan difraksi dihapuskan dan sampel indeks biasan tinggi mengganggu secara konstruktif pada satah imej. Ambil perhatian bahawa gelombang zarah (P) yang terhasil adalah lebih tinggi dalam amplitud daripada gelombang sekeliling (S) dalam kontras fasa negatif. Turut ditunjukkan ialah songsang fasa negatif, di mana vektor gelombang mengelilingi melalui putaran 90 darjah mengikut arah jam gambar rajah vektor.
