Kaedah pemerhatian utama mikroskop optik ialah pemerhatian pendarfluor
Fenomena pendarfluor
Pendarfluor merujuk kepada proses di mana bahan pendarfluor mengeluarkan cahaya dengan panjang gelombang yang lebih panjang hampir serentak apabila disinari dengan cahaya dengan panjang gelombang tertentu (Rajah 1). Apabila cahaya dengan panjang gelombang tertentu (panjang gelombang pengujaan) mengenai molekul (seperti molekul dalam fluorofor), tenaga foton diserap oleh elektron molekul. Seterusnya, elektron beralih daripada keadaan dasar (S0) kepada tahap tenaga yang lebih tinggi, keadaan teruja (S1'). Proses ini dipanggil pengujaan①. Elektron kekal dalam keadaan teruja selama 10-9–10-8 saat, di mana elektron kehilangan sedikit tenaga ②. Dalam proses meninggalkan keadaan teruja (S1) dan kembali ke keadaan dasar ③, baki tenaga yang diserap semasa proses pengujaan akan dibebaskan.
Masa tinggal molekul pendarfluor dalam keadaan teruja ialah jangka hayat pendarfluor, umumnya dalam nanosaat, yang merupakan ciri yang wujud bagi molekul pendarfluor itu sendiri. Teknologi pengimejan menggunakan seumur hidup pendarfluor dipanggil Pengimejan Sepanjang Hayat Pendarfluor (FLIM), yang boleh melakukan pengukuran berfungsi dan tepat yang lebih mendalam selain pengimejan intensiti pendarfluor untuk mendapatkan pengubahsuaian molekul, interaksi antara molekul dan persekitaran mikro molekul. maklumat yang sukar diperoleh dengan pengimejan optik konvensional.
Satu lagi sifat penting pendarfluor ialah anjakan Stokes, perbezaan panjang gelombang antara pengujaan dan puncak pelepasan (Rajah 2). Biasanya panjang gelombang cahaya pancaran lebih panjang daripada panjang gelombang cahaya pengujaan. Ini kerana selepas bahan pendarfluor teruja dan sebelum foton dibebaskan, elektron akan kehilangan sebahagian daripada tenaga melalui proses kelonggaran. Bahan pendarfluor dengan anjakan Stokes yang lebih besar lebih mudah untuk diperhatikan di bawah mikroskop pendarfluor.
Mikroskop Pendarfluor dan Blok Penapis Pendarfluor
Mikroskopi pendarfluor ialah mikroskop optik yang menggunakan sifat pendarfluor untuk memerhati dan imej, dan digunakan secara meluas dalam biologi sel, neurobiologi, botani, mikrobiologi, patologi, genetik dan bidang lain. Pengimejan pendarfluor mempunyai kelebihan sensitiviti yang tinggi dan kekhususan yang tinggi, dan sangat sesuai untuk pemerhatian pengedaran protein tertentu, organel, dan lain-lain dalam tisu dan sel, kajian penyetempatan bersama dan interaksi, dan penjejakan dinamik kehidupan proses seperti perubahan kepekatan ion.
Kebanyakan molekul dalam sel tidak berpendarfluor, dan untuk melihatnya, ia mesti dilabel secara pendarfluor. Terdapat banyak kaedah pelabelan pendarfluor, yang boleh dilabel secara langsung (seperti menggunakan DAPI untuk melabelkan DNA), atau imunostaining menggunakan sifat pengikat antigen antibodi, atau protein sasaran boleh dilabelkan dengan protein pendarfluor (seperti GFP, hijau). protein pendarfluor), atau pengikatan boleh balik. pewarna sintetik (seperti Fura-2), dsb.
Pada masa ini, mikroskop pendarfluor telah menjadi peralatan pengimejan standard pelbagai makmal dan platform pengimejan, dan ia adalah pembantu yang baik untuk eksperimen harian kami. Mikroskop pendarfluor terutamanya dibahagikan kepada tiga kategori: mikroskop pendarfluor tegak (sesuai untuk keratan), mikroskop pendarfluor terbalik (sesuai untuk sel hidup, mengambil kira bahagian), mikroskop stereoskopik pendarfluor (sesuai untuk spesimen yang lebih besar, seperti tumbuhan, ikan zebra (dewasa/ embrio), medaka, organ tikus/tikus, dll.).
Blok penapis pendarfluor ialah komponen teras pengimejan pendarfluor dalam mikroskop. Ia terdiri daripada penapis pengujaan, penapis pelepasan dan pembahagi rasuk dichroic. Ia dipasang dalam roda penapis, seperti Leica DMi8 yang dilengkapi dengan 6-roda penapis kedudukan (Rajah 3). ). Mikroskop yang berbeza mempunyai kedudukan roda yang berbeza, dan sesetengah mikroskop menggunakan slaid penapis.
Blok penapis memainkan peranan penting dalam pengimejan pendarfluor: penapis pengujaan memilih cahaya pengujaan untuk merangsang sampel dan menyekat panjang gelombang cahaya yang lain; cahaya yang melalui penapis pengujaan melalui pemisah rasuk dichroic (peranannya adalah untuk memantulkan cahaya pengujaan dan menghantar pendarfluor), Selepas refleksi, ia difokuskan oleh kanta objektif, disinari kepada sampel, dan pendarfluor yang sepadan teruja untuk memancarkan cahaya. Cahaya yang dipancarkan dikumpulkan oleh kanta objektif, melalui pembahagi rasuk dichroic, dan mencapai penapis pelepasan. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4: panjang gelombang pengujaan ialah 450-490nm, pembahagi rasuk dichroic memantulkan cahaya lebih pendek daripada 510nm, memancarkan cahaya lebih panjang daripada 510nm dan julat penerimaan cahaya pancaran ialah 520-560nm.
Penapis pendarfluor yang biasa digunakan dalam mikroskop pendarfluor boleh dibahagikan kepada dua jenis: laluan panjang (LP untuk pendek) dan laluan jalur (BP untuk pendek). Laluan jalur biasanya ditentukan oleh panjang gelombang pusat dan lebar selang, seperti 480/40, yang bermaksud cahaya dari 460-500nm boleh dilalui. Penapis longpass, seperti 515 LP, menghantar cahaya dengan panjang gelombang lebih panjang daripada 515 nm (Rajah 5).
Bahan pendarfluor mempunyai lengkung pengujaan (penyerapan) ciri dan lengkung pelepasan, puncak pengujaan adalah panjang gelombang pengujaan yang ideal (kecekapan pengujaan tinggi, yang boleh mengurangkan tenaga cahaya pengujaan, melindungi sel dan pewarna), dan lengkung pelepasan ialah panjang gelombang pendarfluor pelepasan julat. Oleh itu, dalam eksperimen, kami akan memilih panjang gelombang sehampir mungkin dengan puncak pengujaan untuk pengujaan, dan julat penerimaan perlu memasukkan puncak pelepasan. Contohnya, puncak pengujaan Alexa Fluor 488 ialah 500nm, dan penapis pengujaan 480/40 boleh dipilih dalam mikroskop pendarfluor.
Butiran kiub penapis boleh dilihat dalam perisian pengimejan mikroskop. Memahami pewarna dan mencari penapis yang paling sepadan dengan sampel anda adalah penting untuk pengimejan pendarfluor. Maklumat spektrum pewarna pendarfluor dan protein pendarfluor biasanya ditunjukkan dalam arahan, dan juga boleh didapati dalam talian.
Sebagai tambahan kepada pengujaan dan panjang gelombang pelepasan probe pendarfluor, pemilihan blok penapis juga perlu mempertimbangkan sama ada terdapat pengujaan tidak khusus dan sama ada terdapat warna silang untuk sampel berlabel pelbagai warna. Di samping itu, adalah perlu untuk mempertimbangkan sumber cahaya pendarfluor yang digunakan. Pada masa ini, sumber cahaya pendarfluor yang biasa digunakan termasuk lampu merkuri, lampu halida logam, dan sumber cahaya LED yang telah berkembang pesat dalam beberapa tahun kebelakangan ini. Spektrum sumber cahaya pendarfluor adalah berterusan atau tidak berterusan, dan tenaga akan berbeza dalam jalur panjang gelombang yang berbeza. Sumber cahaya LED secara beransur-ansur menjadi sumber cahaya utama mikroskop pendarfluor kerana jalur spektrumnya yang agak sempit, output tenaga yang lebih stabil, jangka hayat yang panjang, perlindungan yang lebih selamat dan alam sekitar dan banyak kelebihan lain.
Sebagai tambahan kepada blok penapis terbina dalam mikroskop, terdapat juga roda pantas luaran (Rajah 7). Kelajuan penukaran penapis bersebelahan dengan roda pantas luaran Leica ialah 27ms, yang boleh merealisasikan eksperimen pelbagai warna berkelajuan tinggi, seperti pengimejan kalsium nisbah FRET dan Fura2. (Rajah 8) et al.
Pelbagai jenis teknik pengimejan mikroskop pendarfluor
Untuk memenuhi keperluan pengimejan pendarfluor yang berbeza, sebagai tambahan kepada mikroskop pendarfluor, pelbagai penyelesaian pengimejan mikroskop pendarfluor telah dibangunkan:
Sistem pengimejan definisi tinggi medan lebar, seperti Leica THUNDER Imager, menggunakan teknologi Pembersihan yang inovatif Leica untuk mengalih keluar isyarat gangguan satah bukan fokus dengan cekap semasa pengimejan, mempersembahkan imej yang jelas dan kelebihan pengimejan berkelajuan tinggi;
Mikroskop pengimbasan laser confocal menggunakan lubang jarum untuk menghapuskan gangguan satah bukan fokus, merealisasikan keratan optik, dan memperoleh imej definisi tinggi dan imej tiga dimensi;
Mikroskop resolusi ultra tinggi dan mikroskop nano yang menembusi had pembelauan boleh memerhati struktur halus yang lebih kecil daripada 200 nm;
Sistem pengimejan berbilang foton menggunakan prinsip pengujaan berbilang foton untuk pengimejan tisu tebal dan dalam vivo;
Teknologi pengimejan lembaran cahaya dengan resolusi temporal dan spatial yang tinggi, kelajuan pengimejan yang cepat, resolusi tinggi, fototoksisiti rendah, terutamanya sesuai untuk penyelidikan mengenai pembangunan dan pemerhatian dinamik in vivo;
Pengimejan seumur hidup pendarfluor (FLIM), yang tidak dipengaruhi oleh faktor seperti kepekatan bahan pendarfluor, pelunturan foto, keamatan cahaya pengujaan, dll., boleh melakukan pengukuran berfungsi dan tepat yang lebih mendalam;
Spektroskopi Korelasi Pendarfluor (FCS) dan Spektroskopi Korelasi Silang Pendarfluor (FCCS), mengukur nombor molekul dan pekali resapan molekul pendarfluor, dengan itu menganalisis kepekatan molekul, saiz molekul, kelikatan, gerakan molekul, pengikatan/penceraian molekul, dan sifat optik molekul;
Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRF), dengan resolusi paksi z yang sangat tinggi, sesuai untuk mengkaji struktur molekul dan dinamik permukaan membran sel.
