Perbandingan Teknik Berbeza untuk Mikroskopi Resolusi Super
Untuk mikroskop cahaya konvensional, pembelauan cahaya mengehadkan resolusi pengimejan kepada kira-kira 250 nm. Hari ini, teknik resolusi super boleh menambah baik ini dengan lebih daripada faktor 10. Teknik ini terutamanya dicapai melalui tiga kaedah: mikroskop penyetempatan molekul tunggal, termasuk mikroskop penyetempatan fotosensitif (PALM) dan mikroskop pembinaan semula optik stokastik (STORM); mikroskop pencahayaan berstruktur (SIM); dan mikroskop penyusutan pelepasan terrangsang (STED). Cara memilih teknologi resolusi super ialah perkara yang semua orang ambil berat. "Malangnya, tidak ada prinsip mudah untuk memutuskan kaedah mana yang hendak digunakan, " kata Mathew Stracy, penyelidik pasca doktoral di Universiti Oxford, UK. "Masing-masing ada kelebihan dan kekurangan masing-masing." Para saintis sudah tentu juga memikirkan cara memilih kaedah yang betul untuk projek tertentu. "Dalam konteks pengimejan bio, faktor utama yang perlu dipertimbangkan termasuk: resolusi spatial dan temporal, kepekaan terhadap kerosakan foto, kapasiti pelabelan, ketebalan sampel dan pendarfluor latar belakang atau Pendarfluor autologus sel." Cara ia berfungsi Pelbagai mikroskop resolusi super berfungsi dengan cara yang berbeza. Dalam kes PALM dan STORM, hanya sebahagian kecil penanda pendarfluor yang teruja atau fotoaktif pada masa tertentu, membolehkan penyetempatan bebasnya dengan ketepatan tinggi. Melalui proses ini dengan semua label pendarfluor menghasilkan imej resolusi super yang lengkap. Stefan Hell, salah seorang pemenang Hadiah Nobel Kimia 2014 dan pengarah Institut Kimia Biofizik Max Planck, berkata: "Sistem PALM/STORM agak mudah untuk disediakan, tetapi sukar untuk digunakan, kerana pendarfluor kumpulan mesti mempunyai keupayaan pengaktifan foto. Batasan Kelemahannya ialah mereka perlu mengesan molekul pendarfluor tunggal dalam konteks sel, dan kurang dipercayai daripada STED." STED menggunakan nadi laser untuk merangsang fluorophore dan laser berbentuk cincin untuk memadamkan fluorophore, hanya meninggalkan Pendarfluor bersaiz nanometer pertengahan untuk resolusi super. Mengimbas keseluruhan sampel menghasilkan imej. "Kelebihan STED ialah ia adalah teknologi butang tekan, " jelas Hell. "Ia berfungsi seperti mikroskop pendarfluor confocal standard." Ia juga boleh menggambarkan sel hidup menggunakan fluorofor seperti protein pendarfluor hijau atau kuning dan pewarna yang berasal dari rhodamine. Perbandingan parametrik Walaupun semua teknik resolusi super mengatasi mikroskop cahaya konvensional dari segi resolusi, ia berbeza antara satu sama lain. SIM secara kasar menggandakan resolusi kepada sekitar 100 nm. PALM dan STORM boleh menyelesaikan sasaran 15 nm. Menurut Hell, STED menyediakan resolusi spatial 30 nm dalam sel hidup dan 15 nm dalam sel tetap. Apabila ia datang kepada aplikasi tertentu, kita juga mesti mempertimbangkan nisbah isyarat kepada hingar. Dalam sesetengah kes, peleraian yang lebih rendah tetapi SNR yang lebih tinggi mungkin menghasilkan imej yang lebih baik daripada yang bertentangan (peleraian yang lebih tinggi tetapi SNR yang lebih rendah). Kepantasan pemerolehan imej juga sangat penting, terutamanya untuk sel hidup. "Semua teknik resolusi super adalah lebih perlahan daripada teknik pengimejan pendarfluor konvensional, " kata Stracy. "PALM/STORM adalah yang paling perlahan, ia memerlukan puluhan ribu bingkai untuk mendapatkan satu imej, SIM memerlukan berpuluh-puluh bingkai, dan STED ialah teknologi pengimbasan, jadi kelajuan pemerolehan bergantung pada saiz medan pandangan." Selain sel hidup atau sel Pengimejan tetap, sesetengah saintis juga ingin memahami bagaimana objek bergerak. Stracy berminat untuk memahami dinamik sistem biologi dalam sel hidup, bukan hanya imej statik. Dia menggabungkan PALM dengan pengesanan zarah tunggal untuk menganalisis dinamik dalam sel hidup. Dengan cara ini, dia boleh menjejaki molekul penanda secara terus semasa mereka melaksanakan fungsinya. Walau bagaimanapun, beliau percaya bahawa SIM tidak sesuai untuk mengkaji proses dinamik ini pada peringkat molekul, tetapi kerana kelajuan pemerolehannya yang pantas, ia amat sesuai untuk memerhatikan dinamik struktur yang lebih besar, seperti keseluruhan kromosom. Keputusan terkini Pada 2017, pasukan Hell melaporkan mikroskop resolusi super MINFLUX dalam Sains. Menurut Hell, kaedah resolusi super ini mencapai resolusi spatial 1 nm untuk kali pertama. Di samping itu, ia boleh mengesan molekul individu dalam sel hidup sekurang-kurangnya 100 kali lebih cepat daripada kaedah lain. Para saintis lain juga memuji mikroskop MINFLUX. "Aplikasi dan pendekatan baharu sentiasa dibangunkan, tetapi dua kemajuan menonjol kepada saya," kata Shechtman. Satu ialah MINFLUX. "Ia menggunakan pendekatan yang bijak untuk mendapatkan kedudukan molekul yang sangat tepat." Mengenai perkembangan kedua yang menarik, Shechtman menyebut WE Moerner dan rakan-rakannya di Universiti Stanford. Moerner juga merupakan penerima Hadiah Nobel dalam Kimia 2014. Salah seorang pemenang. Untuk menangani had resolusi pengimejan yang disebabkan oleh penyerakan anisotropik molekul tunggal pendarfluor, saintis menggunakan polarisasi pengujaan yang berbeza untuk menentukan orientasi dan kedudukan molekul. Di samping itu, mereka telah membangunkan permukaan murid yang halus. Teknik ini meningkatkan keupayaan untuk menyetempatkan struktur. Mengenai label pendarfluor Dalam banyak aplikasi resolusi super, label sangat penting. Terdapat juga beberapa syarikat yang menyediakan produk berkaitan. Sebagai contoh, Miltenyi Jerman telah bekerjasama dengan Abberior, sebuah syarikat yang diasaskan oleh Stefan Hell, untuk menyediakan perkhidmatan konjugasi antibodi tersuai untuk pewarna mikroskopi resolusi super. Sebilangan syarikat lain juga menawarkan penanda padanan. "Penggalak Nano kami sangat kecil, hanya 1.5 kDa, dan sangat spesifik," kata Christoph Eckert, pegawai pemasaran di ChromoTek. Protein ini mengikat protein pendarfluor hijau dan merah (GFP dan RFP). Ia berasal daripada serpihan antibodi alpaca, yang dikenali sebagai VHH atau nanobodies, dengan sifat pengikatan yang sangat baik dan kualiti yang stabil tanpa variasi kelompok ke kelompok. Penanda ini sesuai untuk pelbagai teknik resolusi super termasuk SIM, PALM, STORM dan STED. Ai-Hui Tang, penolong profesor di Sekolah Perubatan Universiti Maryland, dan rakan sekerja menggunakan GFP-Booster dan STORM ChromoTek untuk meneroka penyebaran maklumat dalam sistem saraf. Mereka menemui nanocluster molekul, dipanggil nanocolumns, dalam neuron presinaptik dan pascasinaptik. Para saintis percaya bahawa struktur ini menunjukkan bahawa sistem saraf pusat menggunakan prinsip mudah untuk mengekalkan dan mengawal kecekapan sinaptik. Pelbagai versi pengimejan resolusi super dan semakin banyak kaedah membawa saintis lebih mendalam ke dalam misteri biologi. Dengan melanggar had pembelauan cahaya yang boleh dilihat, ahli biologi juga boleh "mengawasi dengan teliti" tindakan sel.
