Pengelasan dan kerja mikroskop untuk penyelidikan sel
Mikroskop adalah alat utama untuk memerhati sel. Menurut sumber cahaya yang berbeza, ia boleh dibahagikan kepada dua kategori: mikroskop optik dan mikroskop elektron. Yang pertama menggunakan cahaya yang boleh dilihat (mikroskop UV menggunakan cahaya ultraviolet) sebagai sumber cahaya, manakala yang kedua menggunakan pancaran elektron sebagai sumber cahaya.
-, Mikroskop optik
(1) Mikroskop optik biasa
Mikroskop biologi biasa terdiri daripada tiga bahagian, iaitu: ① sistem pencahayaan, termasuk sumber cahaya dan pemeluwap; ② sistem pembesaran optik, terdiri daripada kanta objektif dan kanta mata, yang merupakan badan utama mikroskop. Untuk menghapuskan penyimpangan sfera dan penyimpangan kromatik, kedua-dua kanta mata dan objektif ③Peranti mekanikal, digunakan untuk membetulkan bahan dan memudahkan pemerhatian (Rajah 2-1).
Sama ada imej mikroskop jelas bukan sahaja ditentukan oleh pembesaran, tetapi juga berkaitan dengan resolusi mikroskop. Resolusi merujuk kepada keupayaan mikroskop (atau mata manusia berada 25cm dari sasaran) untuk membezakan jarak terkecil antara objek. Saiz resolusi ditentukan oleh Panjang gelombang dan nisbah apertur cahaya dan indeks biasan medium dinyatakan dengan formula:
Dalam formula: n=indeks biasan medium;=sudut bukaan (sudut bukaan spesimen kepada bukaan kanta objektif), NA=bukaan kanta (bukaan angka). Sudut kanta sentiasa kurang daripada 180 darjah, jadi nilai maksimum sina/2 mestilah kurang daripada 1.
Indeks biasan kaca yang digunakan untuk membuat kanta optik ialah 1.65 hingga 1.78, dan indeks biasan medium yang digunakan adalah lebih dekat dengan kaca, lebih baik. Untuk kanta objektif kering, medium ialah udara dan nisbah apertur kanta biasanya 0.05 hingga 0.95; untuk kanta minyak, minyak cedar digunakan sebagai medium, dan nisbah apertur kanta boleh hampir kepada 1.5.
Panjang gelombang cahaya biasa ialah {{0}}nm, jadi nilai resolusi mikroskop tidak akan kurang daripada 0.2μm, dan resolusi mata manusia ialah 0.2mm, jadi pembesaran maksimum reka bentuk mikroskop am biasanya 1000X.
(2) Mikroskopi pendarfluor
Sesetengah bahan dalam sel, seperti klorofil, boleh pendarfluor selepas disinari oleh sinar ultraungu; sesetengah bahan itu sendiri tidak boleh pendarfluor, tetapi jika ia diwarnai dengan pewarna pendarfluor atau antibodi pendarfluor, ia juga boleh pendarfluor apabila disinari oleh sinar ultraungu, dan mikroskop pendarfluor (Rajah 2-2, 3, 4) ialah salah satu alat untuk penyelidikan kualitatif dan kuantitatif mengenai bahan tersebut.
Mikroskop pendarfluor dan mikroskop biasa mempunyai perbezaan berikut:
1. Kaedah pencahayaan biasanya epi-iluminasi, iaitu, sumber cahaya ditayangkan pada sampel melalui kanta objektif (Rajah 2-3);
2. Sumber cahaya adalah cahaya ultraungu, panjang gelombang lebih pendek, dan resolusi lebih tinggi daripada mikroskop biasa;
3. Terdapat dua penapis khas, satu di hadapan sumber cahaya digunakan untuk menapis cahaya yang boleh dilihat, dan satu di antara kanta mata dan kanta objektif digunakan untuk menapis cahaya ultraviolet untuk melindungi mata.
(3) Mikroskop confocal pengimbasan laser
Mikroskop pengimbasan confocal laser (mikroskop pengimbasan confocal laser, Rajah 2-5, 6) menggunakan laser sebagai sumber cahaya pengimbasan dan mengimbas pengimejan titik demi titik, baris demi baris, permukaan demi permukaan dan koleksi laser dan pendarfluor pengimbasan berkongsi kanta objektif, dan fokus kanta objektif ialah Titik fokus laser pengimbasan juga merupakan titik objek pengimejan serta-merta. Oleh kerana panjang gelombang pancaran laser adalah pendek dan pancarannya sangat nipis, mikroskop pengimbasan laser confocal mempunyai resolusi yang lebih tinggi, iaitu kira-kira 3 kali ganda daripada mikroskop optik biasa. Sistem difokuskan sekali dan imbasan terhad kepada satu satah sampel. Apabila kedalaman pemfokusan berbeza, imej tahap kedalaman berbeza sampel boleh diperolehi. Maklumat imej ini disimpan dalam komputer. Melalui analisis dan simulasi komputer, struktur tiga dimensi sampel sel boleh dipaparkan.
Mikroskopi pengimbasan laser confocal boleh digunakan bukan sahaja untuk memerhati morfologi sel, tetapi juga untuk analisis kuantitatif komponen biokimia intraselular, statistik ketumpatan optik dan pengukuran morfologi sel.
(4) Mikroskop medan gelap
Mikroskop medan gelap (mikroskop medan gelap, Rajah 2-7) mempunyai kepingan cahaya di tengah pemeluwap, supaya cahaya pencahayaan tidak terus masuk ke dalam kanta manusia, dan hanya cahaya yang dipantulkan dan dibelaukan oleh spesimen dibenarkan untuk memasuki kanta objektif, jadi latar belakang medan pandangan adalah hitam, Tepi objek adalah terang. Menggunakan mikroskop ini, zarah sekecil 4-200nm boleh dilihat dan peleraian boleh 50 kali lebih tinggi daripada mikroskop biasa.
(5) Mikroskop kontras fasa
Mikroskop Phasecontrast (mikroskop fasakontras, Rajah 2-8, 9) oleh P. Zernike telah dicipta pada tahun 1932 dan memenangi Hadiah Nobel dalam Fizik pada tahun 1953 untuknya. Ciri terbesar mikroskop ini ialah ia boleh memerhati spesimen dan sel hidup yang tidak tercemar.
Prinsip asas mikroskopi kontras fasa adalah untuk menukar perbezaan laluan optik cahaya nampak yang melalui spesimen kepada perbezaan amplitud, dengan itu meningkatkan kontras antara pelbagai struktur dan menjadikan pelbagai struktur kelihatan jelas. Selepas melalui spesimen, cahaya dibiaskan, terpesong dari laluan optik asal, dan ditangguhkan sebanyak 1/4λ (panjang gelombang). Menguatkan, menambah atau mengurangkan amplitud, meningkatkan kontras. Dari segi struktur, mikroskop kontras fasa mempunyai dua ciri khas yang berbeza daripada mikroskop optik biasa:
1. Diafragma anulus terletak di antara sumber cahaya dan pemeluwap, dan fungsinya adalah untuk menjadikan cahaya yang melalui pemeluwap membentuk kon cahaya berongga dan fokus pada spesimen.
2. Plat fasa (plat fasa anulus) menambah plat fasa yang disalut dengan magnesium fluorida dalam kanta objektif, yang boleh melambatkan fasa cahaya langsung atau cahaya terbias sebanyak 1/4λ. Terdapat dua jenis:
①Plat fasa tambah: Cahaya langsung ditangguhkan sebanyak 1/4λ. Selepas dua kumpulan gelombang cahaya digabungkan, gelombang cahaya ditambah bersama, dan amplitud meningkat. Struktur spesimen lebih terang daripada medium sekeliling, membentuk kontras terang (atau kontras negatif).
② Plat fasa B tambah: Cahaya terbias ditangguhkan sebanyak 1/4λ. Selepas dua set sinar digabungkan, gelombang cahaya ditolak, dan amplitud menjadi lebih kecil, membentuk kontras gelap (atau kontras positif), dan strukturnya lebih gelap daripada medium sekeliling.
