Penentuan bilangan mikroorganisma - kaedah pengiraan langsung mikroskop!
Pertumbuhan populasi bakteria dimanifestasikan oleh peningkatan bilangan sel atau peningkatan jisim selular. Kaedah untuk menentukan bilangan sel termasuk kaedah pengiraan mikroskop langsung, kaedah pengiraan koloni plat, kaedah nisbah minyak fotoelektrik, kaedah kebarangkalian maksimum, dan kaedah penapisan membran. Kaedah mengukur bahan sel termasuk penentuan berat kering sel, penentuan komponen selular tertentu seperti kandungan nitrogen, RNA dan DNA, dan penentuan metabolit. Ringkasnya, terdapat banyak kaedah untuk mengukur pertumbuhan mikroorganisma, masing-masing mempunyai kelebihan dan kekurangannya sendiri, dan harus dipilih mengikut situasi tertentu. Percubaan ini terutamanya memperkenalkan kaedah pengiraan langsung mikroskop yang biasa digunakan dalam pengeluaran dan penyelidikan saintifik.
1. Keperluan Tujuan
1. Menjelaskan prinsip kiraan sel darah.
2. Menguasai kaedah mengira mikroorganisma menggunakan pembilang sel darah.
2. Prinsip asas
Kaedah pengiraan terus mikroskop ialah kaedah yang mudah, pantas dan intuitif untuk mengira secara langsung sejumlah kecil ampaian sampel untuk diuji pada slaid kaca khas dengan kawasan dan isipadu tertentu (juga dikenali sebagai pembilang bakteria). Kaedah. Pada masa ini, kaunter bakteria yang biasa digunakan di dalam dan di luar negara ialah: papan pengiraan sel darah, kaunter bakteria Peteroff-Hauser dan kaunter bakteria Hawksley, dll. Mereka boleh digunakan untuk mengira yis, bakteria, spora acuan dan penggantungan lain, dan prinsip asasnya adalah sama. Dua jenis pembilang bakteria yang terakhir mempunyai jumlah isipadu 0.02mm3 selepas ditutup dengan kaca penutup, dan jarak antara kaca penutup dan slaid hanya 0.02mm, jadi minyak kanta objektif rendaman boleh digunakan untuk memerhati dan memerhati sel-sel kecil seperti bakteria. kira. Sebagai tambahan kepada bakteriometer ini, terdapat juga kaedah anggaran untuk nisbah kawasan smear kepada kawasan medan visual yang diperhatikan secara langsung di bawah mikroskop, yang biasanya digunakan untuk pemeriksaan bakteriologi susu. Kelebihan kaedah pengiraan terus mikroskop adalah intuitif, cepat dan mudah dikendalikan. Walau bagaimanapun, kelemahan kaedah ini ialah hasil yang diukur biasanya jumlah sel mati dan hidup. Pada masa ini, terdapat beberapa kaedah untuk mengatasi kekurangan ini, seperti gabungan bakteria berdaya maju yang mengotorkan kultur ruang mikro (masa yang singkat) dan penambahan perencat pembahagian sel untuk mencapai tujuan mengira hanya bakteria yang berdaya maju.
Dalam eksperimen ini, hemositometer digunakan sebagai contoh untuk pengiraan mikroskopik langsung. Untuk penggunaan dua jenis pembilang bakteria yang lain, sila rujuk kepada arahan setiap pengeluar. Mengira terus di bawah mikroskop dengan hemositometer ialah kaedah yang biasa digunakan untuk mengira mikroorganisma. Plat pengiraan adalah slaid kaca khas, di mana tiga platform dibentuk oleh empat slot; platform yang lebih luas di tengah dibahagikan kepada dua bahagian dengan slot melintang pendek, dan terdapat grid pada setiap sisi platform. Setiap grid dibahagikan kepada sembilan petak besar, dan petak besar di tengah ialah bilik pengiraan. Struktur plat pengiraan sel darah ditunjukkan dalam Rajah l{{{{10}}}}. Skala bilik pengiraan umumnya mempunyai dua spesifikasi, satu ialah segi empat sama besar dibahagikan kepada 25 petak tengah, dan setiap petak tengah dibahagikan kepada 16 petak kecil (Rajah 15-2); satu lagi adalah segi empat sama besar. Petak itu dibahagikan kepada 16 petak tengah, dan setiap petak tengah dibahagikan kepada 25 petak kecil, tetapi tidak kira apa jenis papan pengiraannya, terdapat 400 petak kecil dalam setiap petak besar. Panjang sisi setiap petak besar ialah 1mm, dan luas setiap petak besar ialah 1mm2. Selepas ditutup dengan kaca penutup, ketinggian antara kaca penutup dan kaca slaid ialah 0.1mm, jadi isipadu ruang pengiraan ialah 0.lmm3 (seperseribu mililiter). Rajah 15-1 Struktur papan pengiraan sel darah (1) Rajah 15-2 Struktur papan pengiraan sel darah (2) A. Pandangan hadapan; B. Pandangan bahagian membujur; Grid yang diperbesarkan, persegi besar di tengah adalah ruang pengiraan 1. Sel darah Mengira plat; 2. Kaca penutup; 3. Apabila mengira dalam ruang pengiraan, biasanya kira jumlah bilangan bakteria dalam lima petak, kemudian hitung purata setiap petak, dan darab dengan 25 atau 16 untuk mendapatkan Jumlah bilangan bakteria dalam petak besar kemudiannya ditukar kepada jumlah bilangan bakteria dalam 1ml larutan bakteria. Biarkan jumlah bilangan bakteria dalam lima petak itu ialah A, dan nisbah pencairan larutan bakteria itu ialah B. Jika ia adalah plat pengiraan dengan 25 petak, jumlah bilangan bakteria dalam 1 mL larutan bakteria {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(keping) Begitu juga, jika ia adalah plat pengiraan dengan 16 petak sederhana, jumlah bilangan bakteria dalam 1mL larutan bakteria=A/ 5×16×104×B=32000A·B (kepingan)
3. Peralatan
1. Bakteria
Saccharomyces cerevisiae
2. Alat atau perkakas lain
Hemocytometer, mikroskop, penutup penutup, penitis kapilari steril.
4. Langkah-langkah operasi
1. Penyediaan penggantungan bakteria
Saccharomyces cerevisiae telah disediakan ke dalam ampaian bakteria dengan kepekatan yang sesuai dengan garam fisiologi steril.
2. Bilik mengira mikroskop
Sebelum menambah sampel, periksa secara mikroskopik ruang pengiraan plat pengiraan. Sekiranya terdapat kotoran, ia perlu dibersihkan dan dikeringkan sebelum dikira.
3. Tambah sampel
Tutup hemositometer yang bersih dan kering dengan penutup penutup, dan kemudian gunakan penitis kapilari steril untuk menjatuhkan setitik kecil penggantungan Saccharomyces cerevisiae yang digoncang dari tepi penutup penutup, dan biarkan larutan bakteria bergerak secara automatik di sepanjang celah melalui osmosis kapilari. Memasuki bilik mengira, bilik mengira umum boleh diisi dengan cecair bakteria. Apabila pensampelan, goncangkan larutan bakteria terlebih dahulu; apabila menambah sampel, tiada gelembung udara harus dihasilkan dalam ruang pengiraan.
4. Membilang mikroskop
Selepas menambah sampel, diamkan selama 5 minit, kemudian letakkan hemositometer pada peringkat mikroskop, mula-mula cari lokasi ruang pengiraan dengan mikroskop berkuasa rendah, dan kemudian tukar kepada mikroskop berkuasa tinggi untuk mengira. Laraskan keamatan cahaya mikroskop dengan sewajarnya. Bagi mikroskop yang menggunakan cermin untuk pencahayaan, perhatikan untuk tidak menyimpang dari satu sisi cahaya, jika tidak, tidak akan mudah untuk melihat garisan persegi ruang pengiraan dengan jelas dalam bidang penglihatan, atau hanya garis menegak atau garis mendatar akan dilihat. Jika didapati bahawa larutan bakteria terlalu pekat atau terlalu cair sebelum dikira, adalah perlu untuk melaraskan semula pencairan sebelum mengira. Secara amnya, pencairan sampel memerlukan kira-kira 5 hingga 10 bakteria dalam setiap sel kecil. Setiap ruang pengiraan memilih 5 sel tengah (pilihan 4 sudut dan satu sel tengah di tengah) untuk mengira. Sel-sel yang terletak pada garisan grid biasanya hanya dikira pada baris atas dan kanan. Dalam kes tunas yis, apabila saiz tunas mencapai separuh daripada sel induk, ia dikira sebagai dua sel bakteria. Untuk mengira sampel, kira kandungan bakteria sampel dengan mengira nilai purata daripada dua ruang pengiraan.
5. Cuci kiraan sel darah
Selepas digunakan, bilas papan pengira sel darah dengan air dalam paip, jangan gosok dengan objek keras, dan keringkan sendiri atau dengan pengering rambut selepas mencuci. Pemeriksaan mikroskopik untuk melihat sama ada terdapat baki bakteria atau sedimen lain dalam setiap sel kecil. Jika tidak bersih, ia mesti dibasuh berulang kali sehingga bersih.
