Kaedah untuk memperluaskan kedalaman mikroskop multiphoton
Gabungan dua - mikroskop pengimbasan laser foton dan penunjuk kalsium adalah standard emas untuk pengesanan isyarat neuron vivo. Neuron dalam rangkaian saraf diedarkan dalam ruang dimensi tiga -, dan memantau dinamik aktiviti mereka memerlukan cara untuk meningkatkan kadar pengimejan isipadu dengan cepat. Walau bagaimanapun, dengan menggunakan mikroskop multiphoton pengimbasan grating untuk imej sejumlah besar imej, jika objektif aperture (NA) yang tinggi digunakan untuk mencapai resolusi sisi yang lebih tinggi, ia akan menghasilkan kedalaman fokus yang lebih kecil. Untuk mendapatkan pengimejan kelantangan pada kedalaman fokus kecil,
Ia adalah perlu untuk melakukan pengimbasan paksi z - melalui beberapa cara, pengimejan banyak pesawat dengan mengimbas setiap satah fokus, yang sangat mengehadkan kelajuan pengimejan. Jika maklumat imej paksi dapat dikorbankan dan pengimbasan kelantangan dapat dicapai dalam satu imbasan sisi dengan memperluaskan kedalaman fokus, iaitu, maklumat volum diproyeksikan ke imej 2D tunggal, kelajuan pengimejan dapat bertambah baik. Ini dipanggil pengimejan kedalaman fokus (EDF) yang dilanjutkan, yang amat berguna untuk pengimejan struktur populasi jarang yang memerlukan resolusi temporal yang tinggi, seperti pencitraan fungsi aktiviti neuron.
Resolusi paksi dan lateral mikroskop ditentukan oleh apertur berangka (NA) lensa objektif. NA tinggi boleh memaksimumkan resolusi paksi dan lateral serta jumlah cahaya yang dikumpulkan; NA yang lebih rendah akan menghasilkan resolusi paksi yang lebih rendah, iaitu kedalaman fokus yang lebih panjang, tetapi pada masa yang sama mengorbankan resolusi sisi dan kecekapan pengumpulan cahaya. Kaedah memperluaskan kedalaman fokus yang akan diperkenalkan seterusnya dapat mencapai ini sambil mengekalkan resolusi lateral yang tinggi dan fluks cahaya yang mencukupi.
Penggunaan modulator cahaya spatial untuk menjana rasuk bessel langsing fokus dapat mencapai pencitraan EDF, tetapi modulator cahaya spatial adalah besar dan sukar untuk bersesuaian dengan ruang mikroskop sempit; Sebaliknya, modul Bessel berdasarkan piramid paksi adalah murah dan padat, tetapi mereka hanya dapat menjana titik fokus kedalaman tetap dan tidak sesuai untuk pelbagai eksperimen yang memerlukan perubahan berterusan dalam kedalaman fokus. Untuk menangani isu ini, pada tahun 2018, Rongwen Lu et al. Menunjukkan modul bessel berdasarkan axicon, di mana hanya satu lensa perlu diterjemahkan di sepanjang paksi optik untuk terus menyesuaikan panjang paksi titik fokus Bessel.
Rajah 1 (a) Rajah peranti modul Bessel; (b) fungsi penyebaran titik diukur secara eksperimen apabila D adalah -12mm, 0mm, dan 12mm, masing -masing; (c) Hubungan antara lebar penuh lateral pada separuh maksimum, (d) lebar penuh paksi pada separuh maksimum, (e) isyarat puncak, dan (f) kuasa optik di belakang lensa objektif dengan anjakan L2 d
Peranti modul untuk membentuk titik fokus bessel panjang yang berubah -ubah ditunjukkan dalam Rajah 1a. Kejadian rasuk Gaussian dibentuk ke dalam rasuk bulat selepas melalui axicon dan lensa L1. Topeng aperture pekeliling seterusnya boleh menyekat cahaya sesat yang disebabkan oleh kecacatan Axicon, dengan itu membentuk pengedaran paksi dua fungsi penyebaran titik pengujaan -. Selepas itu, rasuk cahaya diproyeksikan ke galvanometer oleh kanta L2 dan L3, dan kemudian mencapai satah fokus belakang kanta objektif melalui kanta L4 dan L5.
Reka bentuk ini sama dengan modul berasaskan piramid tradisional, dengan perbezaannya dengan bergerak L2 atau L3 di sepanjang paksi optik, panjang paksi fokus Bessel dapat diselaraskan secara berterusan. Rajah 1B menunjukkan fungsi penyebaran titik paksi untuk nilai d - 12mm, 0mm, dan 12mm, dengan lebar penuh paksi pada separuh maksimum 39? m, 24? M dan 14? m. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1C-F, menggerakkan lensa L2 dari kiri ke kanan boleh terus mengubah lebar penuh pada separuh maksimum dalam kedua-dua arah melintang dan paksi, yang bermaksud bahawa kedalaman fokus dapat terus berubah. Hasil simulasi berangka berdasarkan teori difraksi vektor adalah dalam persetujuan yang baik dengan data eksperimen. Rajah 2 mengesahkan kesan pembetulan saiz topeng anulus yang berlainan pada kecacatan Axicon. Adalah didapati bahawa topeng anulus yang lebih tipis dapat mengoptimumkan pengedaran intensiti paksi dari rasuk bessel output, tetapi pada masa yang sama, mereka juga membawa kepada lebih banyak kehilangan kuasa.
