Prinsip Mikroskopi Pendarfluor
Mikroskop pendarfluor berbeza daripada mikroskop optik biasa. Daripada memerhati spesimen di bawah pencahayaan sumber cahaya biasa, mereka menggunakan cahaya dengan panjang gelombang tertentu (biasanya cahaya ultraungu, cahaya biru-ungu) untuk mengujakan bahan pendarfluor dalam spesimen di bawah mikroskop untuk menjadikannya mengeluarkan pendarfluor. Oleh itu, Sumber cahaya mikroskop pendarfluor tidak berfungsi sebagai pencahayaan langsung, tetapi sebagai sumber tenaga yang mengujakan bahan pendarfluor dalam spesimen. Sebab mengapa kita boleh memerhati spesimen adalah disebabkan oleh pencahayaan sumber cahaya, tetapi fenomena pendarfluor yang dibentangkan selepas bahan pendarfluor dalam spesimen menyerap tenaga cahaya teruja.
Ia boleh dilihat bahawa ciri mikroskop pendarfluor ialah sumber cahayanya boleh membekalkan sejumlah besar cahaya pengujaan dalam julat panjang gelombang tertentu, supaya bahan pendarfluor dalam spesimen yang diuji boleh mendapatkan cahaya pengujaan keamatan yang diperlukan. Pada masa yang sama, mikroskop pendarfluor mesti mempunyai sistem penapis yang sepadan.
Mikroskopi pendarfluor ialah alat penting dalam histokimia imunofluoresensi. Ia terdiri daripada sumber cahaya ultra-tinggi voltan, sistem penapis (termasuk pengujaan dan plat penapis penindasan), sistem optik dan sistem fotografi dan komponen utama yang lain. Ia menggunakan cahaya dengan panjang gelombang tertentu untuk merangsang spesimen untuk memancarkan pendarfluor.
Cara untuk merangsang pendarfluor: Mengikut julat panjang gelombang cahaya, ia boleh dibahagikan kepada dua jenis: kaedah pengujaan UV (menggunakan kaedah pencahayaan ultraviolet) dan kaedah pengujaan BV (menggunakan cahaya biru-ungu). Kaedah pengujaan UV menggunakan cahaya ultraungu hampir lebih pendek daripada 400nm untuk pengujaan. Tiada cahaya pengujaan yang kelihatan dalam kaedah ini, jadi pendarfluor yang diperhatikan membentangkan pendarfluor yang wujud bagi pewarna, dan mudah untuk membezakan pendarfluor khusus pada spesimen daripada autopendarfluor tisu latar belakang.
Kaedah pengujaan BV adalah berdasarkan 404nm dan 434nm untuk pengujaan daripada ultraungu kepada cahaya biru. Kaedah ini menggunakan cahaya biru untuk menyinari spesimen, jadi penapis potong sistem cerapan pendarfluor mesti menggunakan penapis yang boleh menghalang sepenuhnya cahaya biru dan melepasi sepenuhnya pendarfluor hijau dan kuning yang diperlukan. Pewarna pendarfluor untuk ujian antibodi pendarfluor. Panjang gelombang penyerapan maksimum cahaya pengujaan adalah agak hampir dengan panjang gelombang pancaran maksimum pendarfluor, jadi penapis yang digunakan dalam kaedah pengujaan BV mesti menggunakan penapis pemotongan tajam. Kaedah ini boleh menggunakan cahaya biru sebagai cahaya pengujaan, jadi kecekapan penyerapan pigmen pendarfluor lebih tinggi, dan imej yang lebih cerah boleh diperolehi. Kelemahannya ialah pendarfluor di bawah 500nm tidak dapat dilihat, dan pendarfluor melebihi 500nm menjadikan keseluruhan imej kelihatan kuning. Dalam kaedah antibodi pendarfluor, kekhususan fluorokrom selalunya dinilai oleh warna unik kepada fluorokrom. Oleh itu, apabila membincangkan kekhususan halus, kelemahan kaedah pengujaan BV yang disebutkan di atas sering mempunyai pengaruh yang besar.
Sebagai kesimpulan, pencahayaan mikroskop pendarfluor boleh dipertimbangkan mengikut tiga titik berikut mengikut struktur pemeluwap dan panjang gelombang cahaya pengujaan.
① Dari perspektif keperluan kontras imej pendarfluor, penumpu medan gelap pengujaan UV digunakan untuk pencahayaan.
② Memandangkan kecerahan imej, penapis pengujaan BV mempunyai kecekapan pemerhatian medan gelap yang paling tinggi.
③Ciri-ciri penapis pengujaan UV pemerhatian medan gelap dan pencahayaan penumpu medan gelap pengujaan BV boleh dianggap sebagai antara kedua-dua kaedah pencahayaan ini, tetapi yang pertama mempunyai sifat medan gelap yang lebih kuat dan memaparkan imej yang lebih terang. Kontrasnya kecil; yang kedua mengekalkan sifat laluan cahaya medan gelap, jadi imej yang dipaparkan adalah lebih gelap, dan kontras dipertingkatkan. Apabila sebenarnya menggunakan mikroskop pendarfluor, kaedah pencahayaan yang paling sesuai dengan keperluan spesimen hendaklah digunakan untuk pemerhatian.
Perlu ditegaskan bahawa walaupun kondenser medan gelap yang teruja UV dengan kontras terbaik diterangi, sebahagian daripada cahaya pengujaan ultraungu yang dibiaskan atau dihamburkan oleh spesimen akan memasuki kanta objektif. Autofluoresensi boleh memburukkan tindak balas imej. Oleh itu, penapis penyerap UV mesti digunakan di hadapan kanta mata sebagai penapis potong.
