Prinsip Laser Confocal Microscopy (LSCM)
Mikroskop confocal laser menggunakan lubang jarum pencahayaan yang diletakkan di belakang sumber cahaya dan lubang jarum pengesanan diletakkan di hadapan pengesan untuk mencapai pencahayaan titik dan pengesanan titik. Cahaya dari sumber cahaya difokuskan pada satu titik dalam satah fokus sampel oleh cahaya yang dipancarkan melalui lubang jarum pencahayaan, dan pendarfluor yang dipancarkan dari titik itu diimejkan dalam lubang jarum pengesanan, dan sebarang cahaya yang dipancarkan di luar titik itu disekat oleh lubang jarum pengesanan. Lubang jarum pencahayaan dan lubang jarum pengesan adalah konjugat untuk titik yang diterangi atau dikesan, supaya titik yang dikesan adalah titik confocal dan satah di mana titik yang dikesan terletak adalah satah confocal. Komputer memaparkan titik yang dikesan pada skrin komputer dalam bentuk titik imej. Untuk menghasilkan imej yang lengkap, sistem pengimbasan dalam laluan optik mengimbas pada satah fokus sampel, dengan itu menghasilkan imej konfokal yang lengkap. Selagi peringkat pembawa digerakkan ke atas dan ke bawah sepanjang paksi Z, tahap baharu sampel dipindahkan ke satah confocal, dan tahap baharu sampel diimej pada monitor, apabila paksi Z terus bergerak, imej potongan cahaya berturut-turut daripada tahap sampel yang berbeza diperolehi.
Mikroskop optik tradisional menggunakan sumber cahaya medan, imej setiap titik pada spesimen akan diganggu oleh pembelauan atau penyerakan cahaya dari titik jiran; mikroskop confocal pengimbasan laser menggunakan pancaran laser melalui lubang jarum yang diterangi untuk membentuk sumber cahaya titik pada spesimen yang diimbas pada setiap titik satah fokus dalaman, spesimen pada titik penyinaran, pengimejan lubang jarum pengesanan, dengan pengesanan lubang jarum. selepas titik tiub pendaraban cahaya (PMT) atau peranti electrocoupled sejuk (cCCD) Diterima titik demi titik atau baris demi baris, imej pendarfluor terbentuk dengan cepat pada skrin monitor komputer. Lubang jarum pencahayaan dan lubang jarum pengesanan relatif kepada satah fokus kanta objektif adalah konjugat, titik pada satah fokus pada masa yang sama tertumpu pada lubang jarum pencahayaan dan lubang jarum pelepasan, titik di luar satah fokus tidak akan berada dalam pengesanan lubang jarum pada pengimejan, supaya imej confocal yang diperolehi adalah keratan rentas optik spesimen, mengatasi kekurangan imej mikroskop biasa kabur.
Dari prinsip asas, mikroskop laser confocal adalah mikroskop optik moden, ia adalah mikroskop cahaya biasa daripada teknologi untuk membuat penambahbaikan berikut.
1. Gunakan laser sebagai sumber cahaya kerana monokromatik laser adalah sangat baik, panjang gelombang pancaran sumber cahaya adalah sama, secara asasnya menghapuskan penyimpangan kromatik.
2. Penggunaan teknologi confocal dalam satah fokus kanta objektif diletakkan di tengah dengan lubang kecil dalam penyekat, satah fokus di luar menghalang cahaya sesat, menghapuskan penyimpangan sfera; dan seterusnya menghapuskan penyimpangan kromatik.
3. Mikroskop confocal laser menggunakan teknologi pengimbasan titik untuk menguraikan sampel menjadi ruang dua dimensi atau tiga dimensi menjadi titik yang tidak terkira banyaknya, dengan pancaran laser yang sangat kecil (sumber cahaya titik) titik demi titik, pengimejan pengimbasan baris demi baris, dan kemudian melalui gabungan mikrokomputer bagi keseluruhan satah atau imej tiga dimensi. Mikroskop cahaya tradisional ialah sumber cahaya medan di bawah pengimejan sekali sahaja, spesimen pada setiap titik imej akan bersebelahan dengan titik cahaya difraksi dan gangguan cahaya berselerak. Kejelasan dan ketepatan kedua-dua imej ini tidak dapat dibandingkan.
4. Pemerolehan dan pemprosesan isyarat optik dengan komputer dan penguatan isyarat dengan tiub photomultiplier
Dalam mikroskop laser confocal, komputer menggantikan mata atau kamera manusia untuk pemerhatian dan rakaman video, dan imej yang diperolehi didigitalkan dan boleh diproses dalam komputer untuk meningkatkan kejelasan imej semula. Lebih-lebih lagi, penggunaan tiub photomultiplier boleh menguatkan isyarat yang sangat lemah, meningkatkan sensitiviti. Hasil daripada gabungan penggunaan teknologi di atas, boleh dikatakan bahawa LSCM adalah mikroskop yang paling maju di dunia. Ia boleh dikatakan bahawa LSCM adalah gabungan teknologi pengeluaran mikroskop, teknologi fotoelektrik, teknologi komputer **, adalah produk yang tidak dapat dielakkan daripada pembangunan teknologi moden.
