Prosedur Standard untuk Penentukuran Polarizer dalam Mikroskop Polarizing
Mikroskop pendarfluor berbeza daripada mikroskop optik biasa kerana ia tidak memerhati spesimen di bawah pencahayaan sumber cahaya biasa. Sebaliknya, ia menggunakan panjang gelombang cahaya tertentu (biasanya cahaya ultraungu, cahaya ungu biru) untuk merangsang bahan pendarfluor di dalam spesimen di bawah mikroskop, menyebabkan ia mengeluarkan pendarfluor. Oleh itu, peranan sumber cahaya dalam mikroskop pendarfluor bukanlah pencahayaan langsung, tetapi sebagai sumber tenaga untuk merangsang bahan pendarfluor di dalam spesimen. Sebab mengapa kita boleh memerhati spesimen bukan disebabkan oleh pencahayaan sumber cahaya, tetapi fenomena pendarfluor yang dipamerkan oleh bahan pendarfluor di dalam spesimen selepas menyerap tenaga cahaya teruja. Daripada ini, dapat dilihat bahawa ciri mikroskopi pendarfluor adalah terutamanya sumber cahayanya boleh membekalkan sejumlah besar cahaya pengujaan dalam julat panjang gelombang tertentu, supaya bahan pendarfluor dalam spesimen boleh memperoleh keamatan cahaya pengujaan yang diperlukan. Pada masa yang sama, mikroskop pendarfluor mesti mempunyai sistem penapis yang sepadan. Mikroskop pendarfluor ialah alat asas dalam kimia tisu pendarfluor. Ia terdiri daripada komponen utama seperti sumber cahaya ultra-tinggi, sistem penapis (termasuk plat penapis pengujaan dan penindasan), sistem optik dan sistem fotografi. Ia menggunakan cahaya dengan panjang gelombang tertentu untuk merangsang spesimen dan memancarkan pendarfluor.
1. Kaedah pengujaan pendarfluor: Mengikut julat panjang gelombang cahaya, terdapat dua jenis: kaedah pengujaan UV (menggunakan pencahayaan ultraviolet) dan kaedah pengujaan BV (menggunakan cahaya ungu biru). Kaedah pengujaan UV menggunakan cahaya ultraviolet berhampiran lebih pendek daripada 400nm untuk pengujaan. Kaedah ini tidak mempunyai cahaya pengujaan yang boleh dilihat, jadi pendarfluor yang diperhatikan mempamerkan pendarfluor yang wujud bagi pewarna, menjadikannya mudah untuk membezakan pendarfluor khusus pada spesimen daripada pendarfluor sendiri tisu latar belakang.
2. Kaedah pengujaan BV: Ia melibatkan pengujaan daripada ultraungu kepada cahaya biru berpusat pada 404nm dan 434nm. Kaedah ini menggunakan cahaya biru untuk menyinari spesimen, jadi penapis-off sistem cerapan pendarfluor mesti menggunakan penapis yang boleh menyekat sepenuhnya cahaya biru dan melepasi sepenuhnya pendarfluor hijau dan kuning yang diperlukan. Pigmen pendarfluor digunakan untuk kaedah antibodi pendarfluor. Panjang gelombang penyerapan maksimum cahaya pengujaan dan panjang gelombang pancaran maksimum pendarfluor adalah agak rapat, jadi penapis yang digunakan dalam kaedah pengujaan BV mesti menggunakan penapis potongan tajam. Kaedah ini boleh menggunakan cahaya biru sebagai cahaya pengujaan, jadi kecekapan penyerapan pigmen pendarfluor adalah tinggi, dan imej yang lebih terang boleh diperolehi. Kelemahannya ialah pendarfluor di bawah 500nm tidak dapat dilihat, manakala pendarfluor melebihi 500nm menjadikan keseluruhan imej kelihatan kuning. Dalam kaedah antibodi pendarfluor, kekhususan kebanyakannya ditentukan oleh warna unik untuk pigmen pendarfluor, jadi apabila membincangkan kekhususan halus, kelemahan kaedah pengujaan BV yang disebutkan di atas sering mempunyai kesan yang ketara.
